Il modo in cui le cellule mantengono l'omeostasi proteica non è ben compreso nel contesto dello stress cellulare e della senescenza. In questo protocollo, forniamo un modo semplice e preciso per calcolare il turnover proteico, che è un componente chiave dell'omeostasi proteica nelle cellule viventi. Pulse SILAC offre a uno sperimentatore la possibilità di misurare il turnover proteico per le singole proteine e l'intero proteoma in un modo ad alto rendimento che è anche più autentico per i sistemi biologici rispetto ad altri metodi.
I principi di questo metodo possono essere applicati a qualsiasi sistema che può essere metabolicamente etichettato, compresi interi organismi. Questo metodo può anche portare a intuizioni sulla senescenza cellulare, l'invecchiamento e le malattie neurodegenerative. L'analisi della spettrometria di massa è altamente sensibile a determinati contaminanti chimici, come i detergenti.
Utilizzare reagenti di grado LC-MS durante questa procedura per garantire una raccolta dati di alta qualità. Per iniziare l'etichettatura metabolica delle cellule, sostituire il mezzo per tre piastre ciascuna di cellule senescenti e quiescenti con 30 millilitri di mezzi SILAC Light. Separatamente, sostituire il mezzo per tre piastre senescenti e tre quiescenti con 30 millilitri di SILAC Heavy.
Far crescere le cellule per tre giorni senza cambiare il mezzo. Per staccare le cellule dalle piastre di coltura, aggiungere cinque millilitri di reagente di tripsina preriscaldato a ciascuna piastra e incubare le piastre per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, risospese le cellule staccate in cinque millilitri dello stesso mezzo utilizzato per la coltura per un volume totale di 10 millilitri.
Quindi, trasferire le cellule sul ghiaccio e centrifugare le cellule a 300 volte G a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato il pellet due volte, ruotare nuovamente le cellule e rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet in 150 microlitri di urea a otto molari appena preparata e tampone di lisi di bicarbonato di ammonio 50 millimolare. Mescolare il contenuto del tubo pipettando su e giù.
Aliquota 50 microgrammi del campione proteico in una nuova provetta e porta i campioni fino a volumi uguali con tampone di lisi. Quindi aggiungere il ditiotreitolo a una concentrazione finale di 20 millimolari al tubo e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione. Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti prima di aggiungere iodoacetammide a una concentrazione finale di 40 millimolare e incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
Quindi diluire il campione al di sotto dell'urea monomolare con un tampone di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari. Aggiungere un microgrammo di tripsina per 50 microgrammi di proteina iniziale o a 1:50 tripsina al rapporto proteina al campione. Incubare il campione durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione per digerire le proteine in peptidi.
Il giorno successivo, aggiungere acido formico all'1% in volume del campione per estinguere la digestione delle proteine. Per la pulizia del campione, posizionare una cartuccia di estrazione in fase solida su un collettore a vuoto, utilizzando una cartuccia di estrazione per ciascun campione, secondo le linee guida del produttore. Dopo l'estrazione, rimuovere i campioni peptidici dal collettore a vuoto e asciugarli completamente in un concentratore di vuoto.
L'essiccazione richiede circa tre ore. Per la spettrometria di massa, o analisi MS, risospesare il campione peptidico ad una concentrazione di 400 nanogrammi per microlitro in un tampone di acido formico allo 0,2%. Per risolubilizzare i peptidi, mescolare il campione per cinque minuti.
Quindi, sonicare per cinque minuti in un sonicatore a bagnomaria. Quindi, centrifugare il campione per pellettare i materiali insolubili e trasferire i supernatanti peptidici in flaconcini di SM. Presentare i campioni per l'analisi proteomica utilizzando la spettrometria di massa tandem a cromatografia liquida o LC-MS-MS.
Utilizzare le impostazioni consigliate per l'analisi non mirata da parte della struttura di spettrometria di massa. Caricare i campioni su una colonna analitica con una portata di 400 nanolitri al minuto per eluire i peptidi su un gradiente lineare di 90 minuti utilizzando una miscela di solventi organici e inorganici, con il solvente organico che va dal 5 al 35% Acquisire dati di spettrometria di massa in modalità dipendente dai dati, con un ciclo continuo di scansioni di indagine MS1 seguite da 20 scansioni MS2 dipendenti dai dati con frammentazione HCD. Quantificare le aree di picco peptidico per peptidi pesanti e leggeri nello strumento software Proteome Quantitation.
Quindi, esporta le aree di picco peptidico pesanti e leggere. Per il calcolo delle emivite proteiche, aprire la cartella di lavoro di analisi SILAC al primo foglio denominato Raw Data e incollare negli ID UniProt, nomi di geni, aree di picco pesanti e leggere nelle colonne indicate. Quindi, aprire il quarto foglio denominato Analisi e rimuovere le righe in cui le colonne G e H indicano che l'esempio è fuori dall'intervallo e mantenere le righe che vengono lette all'interno dell'intervallo.
I fenotipi senescenti sono stati convalidati utilizzando l'attività beta-galattosidasi associata alla senescenza e l'analisi RT-qPCR. Per l'attività della beta-galattosidasi, le cellule senescenti apparivano blu, mentre le cellule di controllo quiescenti avevano un colore nullo o minimo. Nell'analisi RT-qPCR, le cellule senescenti hanno mostrato mRNA interleuchina-6, CXCL8 e CDKN1A-P21 più elevati rispetto alle cellule quiescenti.
Al contrario, il livello di lamina B1 che codifica per il marcatore di proliferazione era basso o assente nelle cellule senescenti. I cromatogrammi ionici estratti dei peptidi hanno rivelato la proporzione relativa di segnali peptidici pesanti e leggeri. Una percentuale inferiore di segnali peptidici pesanti rispetto alle cellule senescenti leggere indicava un tasso di turnover proteico più lento e un segnale peptidico pesante più elevato rispetto alla luce indicava un tasso di turnover proteico più veloce.
I campioni non etichettati hanno mostrato poco o nessun segnale peptidico pesante. Sono state calcolate le emivite per 695 proteine identificate dall'analisi di spettrometria di massa. L'emivita è riportata come un rapporto log-due di cellule senescenti su quiescenti e tracciata in un grafico vulcanico.
Seguendo il calcolo dei tassi di turnover proteico nelle cellule senescenti, l'analisi a valle può rivelare percorsi biologici candidati che sono regolati da meccanismi di proteostasi. Pulse SILAC ha spianato la strada ai ricercatori per studiare la dinamica delle proteine con granularità e produttività senza precedenti, consentendoci di studiare i cambiamenti nell'omeostasi proteica in molte singole proteine.
