Isolamento del virus associato alle zanzare dalle zanzare raccolte sul campo

Riepilogo

Numerose nuove sequenze simili a virus sono state trovate nelle zanzare a causa dell'ampio uso di tecnologie di sequenziamento. Forniamo una procedura efficace per isolare e amplificare i virus utilizzando linee cellulari di vertebrati e zanzare, che potrebbero servire come base per studi futuri sui virus associati alle zanzare, compresi i virus trasmessi dalle zanzare e specifici per le zanzare.

Abstract

Con l'ampia applicazione delle tecnologie di sequenziamento, molte nuove sequenze simili a virus sono state scoperte negli artropodi, comprese le zanzare. Le due categorie principali di questi nuovi virus associati alle zanzare sono "virus trasmessi dalle zanzare (MBV)" e "virus specifici delle zanzare (MSV)". Questi nuovi virus potrebbero essere patogeni sia per i vertebrati che per le zanzare, o potrebbero semplicemente essere simbiotici con le zanzare. I virus entità sono essenziali per confermare i caratteri biologici di questi virus. Pertanto, qui è stato descritto un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'amplificazione del virus dalle zanzare raccolte sul campo. In primo luogo, i campioni di zanzara sono stati preparati come surnatanti di omogenati di zanzare. Dopo due centrifugazioni, i surnatanti sono stati poi inoculati nella linea cellulare di zanzara C6/36 o nella linea cellulare di vertebrati BHK-21 per l'amplificazione del virus. Dopo 7 giorni, i surnatanti sono stati raccolti come supernatanti P1 e conservati a -80 °C. Successivamente, i supernatanti P1 sono stati fatti passare altre due volte nelle cellule C6/36 o BHK-21 mentre lo stato della cellula veniva controllato quotidianamente. Quando è stato scoperto l'effetto citopatogeno (CPE) sulle cellule, questi surnatanti sono stati raccolti e utilizzati per identificare i virus. Questo protocollo serve come base per la ricerca futura sui virus associati alle zanzare, inclusi MBV e MSV.

Introduzione

Le zanzare sono un gruppo di importanti vettori di artropodi patogeni. Ci sono circa 3.500 specie di zanzare nella famiglia Culicidae ^1,2. Lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento ha portato alla scoperta di molte nuove sequenze simili a virus nelle zanzare provenienti da diverse parti del mondo³. Generalmente, questi virus associati alle zanzare possono essere classificati in due gruppi principali: MBV e MSV.

Gli MBV sono un gruppo di virus diversi che sono agenti causali di molte malattie umane o animali, come il virus della febbre gialla (YFV), il virus della dengue (DENV), il virus dell'encefalite giapponese (JEV), il virus del Nilo occidentale (WNV) e il virus della febbre della Rift Valley (RVFV)⁴. Hanno seriamente minacciato la salute pubblica causando gravi morbilità e mortalità sia negli esseri umani che negli animali in tutto il mondo. Gli MBV sostengono naturalmente un ciclo di vita tra diversi ospiti attraverso la trasmissione da una zanzara infetta a un ospite ingenuo, nonché da un ospite infetto da virus e da una zanzara nutriente⁵. Pertanto, questi virus possono infettare sia le linee cellulari di zanzara che le linee cellulari di vertebrati nel laboratorio¹.

Gli MSV, che includono il virus Yichang (YCN), il flavivirus Culex (CxFV) e il virus Chaoyang (CHAOV), sono un sottogruppo di virus specifici per insetti ^1,6,7. Negli ultimi anni, c'è stato un aumento nella scoperta di nuovi MSV e alcuni di questi MSV hanno avuto un impatto sulla trasmissione di MBV. Ad esempio, CxFV, che può essere un'infezione persistente in Culex pipiens, potrebbe sopprimere la replicazione WNV in una fase iniziale⁸. Un altro flavivirus specifico per insetti, il virus dell'agente di fusione cellulare (CFAV), è stato trovato per inibire la propagazione del virus DENV e Zika (ZIKV) nelle zanzare Aedes aegypti ⁹. Pertanto, questo protocollo è un approccio utile per isolare i virus associati alle zanzare e può aiutare in ulteriori ricerche sulla distribuzione di agenti patogeni legati alle zanzare e sul controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare.