Questa è la prima volta che viene sviluppato un metodo per la misurazione risolta nel tempo dei livelli di trasmettitori peptidici in vivo. Possiamo misurare i livelli di trasmettitori peptidici in singoli soggetti e posizioni discrete con analisi quasi in tempo reale. Per prima cosa, taglia una lunghezza di 25 centimetri di filo di platino rivestito di perfluoroaltossico.
Quindi, usando un bisturi, rimuovere circa cinque millimetri di rivestimento perfluoroallossico da un'estremità, facendo attenzione a non tagliare il filo di platino. Ora, inserisci l'estremità spogliata del filo di platino in un pin del connettore maschio da un millimetro placcato in oro. Quindi, utilizzando pinze ad ago, crimpare i denti del pin del connettore attorno all'estremità spogliata del filo di platino e saldare il filo di platino al pin del connettore placcato in oro.
Quindi, preparare la soluzione di dopamina aggiungendo 50 milligrammi di dopamina cloridrato in 50 millilitri di PBS 10 millimolari con pH sei e mescolare mescolando. Dopo aver completamente sciolto la dopamina, posizionare la punta del filo di platino nel recipiente contenente il PBS appena fatto con dopamina. Collegare l'elettrodo a disco di cloruro d'argento al canale di terra nello stadio di testa.
Quindi, posizionare il disco di cloruro d'argento nel recipiente contenente PBS integrato con dopamina e filo di platino. Prima di procedere ulteriormente, collegare uno shunt di filo ai canali di riferimento dello stadio di testa. Aprire il software di acquisizione dati interattivo e impostare un protocollo di potenziale di comando di elettrodeposizione a dente di sega impostando il potenziale di avvio a meno 0,6 volt, il potenziale finale a 0,65 volt, la velocità di scansione a 0,04 volt al secondo e la durata della deposizione a 420 secondi.
Dopo aver completato la deposizione di poli-dopamina, rimuovere il pellet macinato di cloruro d'argento e la punta del filo di platino dalla nave. Posizionare la punta del filo in un microtubo contenente PBS di pH 7,4 per due-cinque minuti e assicurarsi che la punta del filo non contatti i lati o il fondo del microtubo. Quindi, preparare la soluzione anticorpale combinando l'anticorpo di interesse con il PBS di pH 7,4 in un rapporto 1:20 in un recipiente di dimensioni appropriate.
Quindi, immergere la punta depositata di poli-dopamina dell'elettrodo di platino in soluzione anticorpale per due ore a temperatura ambiente, assicurandosi che la punta del filo di platino sia sospesa in soluzione e non appoggiata sulla superficie interna del microtubo. Posizionare la punta funzionale dell'immunosonda capacitiva nella camera di flusso, facendo attenzione a non disturbare in alcun modo la punta dell'elettrodo, in quanto ciò potrebbe danneggiare la punta sensoriale della sonda. Prima del primo test sperimentale, eseguire una corsa standard TBS per condizionare la sonda immunosonda capacitiva e, per il protocollo di tensione, impostare il potenziale di passo positivo a 110 millivolt, il potenziale di passo negativo a meno cinque millivolt, la durata del passo di 20 millisecondi e la durata dell'acquisizione a 600 secondi.
Quindi, creare la soluzione peptidica di interesse utilizzando lo stesso TBS per mantenere la composizione del superfusato. Impostare un sistema di collettori in cui il superfusato può essere commutato tra TBS e TBS integrato con peptidi. Utilizzare i parametri standard TBS e impostare il protocollo di acquisizione dei dati di rilevamento peptidico impostando la durata dell'acquisizione su 360 secondi.
Prima della deposizione di poli-dopamina, infilare la punta esposta dell'elettrodo a filo di platino attraverso un ago ipodermico calibro 22, lasciando circa due millimetri oltre la punta dell'ago. Usa una pinza e piega delicatamente la punta dell'elettrodo a filo di platino per creare una barra che pende dall'estremità dell'ago ipodermico. Prelevare delicatamente l'ago dalla punta spinata, lasciando abbastanza filo da posizionare nel vaso senza che l'ago contatti il fluido e procedere con la deposizione di dopamina come dimostrato in precedenza.
Ora, risciacquare la punta della sonda spinata con PBS e posizionarla nella soluzione anticorpale. Quindi, rimuovere delicatamente la punta funzionalizzata dal PBS. Spostare l'ago ipodermico sull'immunosonda capacitiva spinata e impiantarlo delicatamente nella regione di interesse prima di collegare il perno del connettore d'oro allo stadio principale.
Una volta impiantato, prelevare l'ago ipodermico, lasciando l'elettrodo in posizione. Un passo positivo nel potenziale di comando misura la corrente di iniezione necessaria per bloccare la tensione della sonda e consente la misurazione della corrente capacitiva. Il passo del potenziale di comando negativo cancella il peptide legato dall'anticorpo tramite repulsione elettrostatica.
La forma d'onda del comando della funzione step raffigurava il rilevamento iterativo risolto nel tempo e la quantificazione del peptide. La traccia inferiore rappresentava il potenziale di comando e la corrente risultante sotto la superfusione della sonda in TBS. L'immunosonda capacitiva equilibrata ha mostrato un decadimento iniziale più piccolo e una linea di base stabile per sei minuti.
Il flusso di neuropeptide Y nella camera di flusso ha aumentato le correnti capacitive rispetto al basale. Le correnti immunosonda capacitive misurate con una sonda funzionalizzata con anticorpi neuropeptide Y hanno mostrato un segnale dipendente dalla concentrazione sensibile al neuropeptide Y a basso contenuto di picomolo Per la calibrazione, è stata misurata una curva standard per tutte le concentrazioni testate. La stimolazione del ganglio stellato bilaterale ha mostrato un elevato neuropeptide Y quando co-tracciato con le correnti capacitive di controllo negativo.
Il rilascio di noradrenalina misurato sotto stimolazione stellata ha mostrato un rilascio sincrono con neuropeptide Y, coerente con una risposta simpatica evocata. Lo sviluppo di queste tecniche può fornire letture intraoperatorie di modulatori chiave dell'attività cardiaca, fornendo così una potenziale guida terapeutica o interventistica rapida. La tecnica qui presentata è specifica per la distribuzione cardiovascolare, tuttavia, la tecnica stessa è appropriata per altri contesti fisiologici, come urina, muscolo scheletrico, reni, tessuto adiposo, eccetera.
