Questo modello consentirà ai ricercatori nelle fasi precliniche critiche di determinare con maggiore precisione l'efficacia antimicrobica delle nuove formulazioni e offre ai ricercatori un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci. Questo modello consente risultati rapidamente riproducibili in un ambiente di ferita rappresentativo. Riduce la necessità di animali allevati appositamente e facilita la traduzione più rapida degli antimicrobici topici per le infezioni delle ferite in clinica.
Le sfide principali sono la contaminazione e la destrezza. Una rigorosa tecnica asettica e pazienza con la lavorazione dei tessuti sono essenziali; per il successo di questo metodo è necessaria una rimozione precisa e mirata del lembo. Inizia con la disinfezione delle pinze esponendoli alla sterilizzazione a calore secco a 200 gradi Celsius per un'ora.
Autoclavare tutti i bicchieri a 121 gradi Celsius per 15 minuti prima dell'uso. Disinfettare la sezione frontale della lampada versando circa 100 millilitri di soluzione di biossido di cloro da 200 PPM sull'area del campione. Rasare la sezione della fronte con tagliatrici elettriche, seguita da un lavaggio con 200 millilitri di soluzione di biossido di cloro da 200 PPM.
Pulire l'area con etanolo e un rotolo blu e coprire l'area del campione con una crema depilatoria. Dopo 35 minuti, raschiare delicatamente la crema depilatoria utilizzando uno strumento raschiante e valutare l'area del campione. Ripetere il processo di depilazione se rimane una quantità significativa di peli.
Risciacquare l'area del campione pulita con 200 millilitri di soluzione di biossido di cloro seguita da etanolo e un rotolo blu. Utilizzare un pugno sterile da otto millimetri per biopsia per ritagliare un campione di pelle di otto millimetri dall'area preparata. Quindi rimuovere il campione utilizzando una pinza sterile e un bisturi a lama numero 15, assicurandosi che tutto il grasso cutaneo venga rimosso.
Mettere i campioni in un barattolo sterile da 0,5 litri riempito con PBS sterile. Quindi trasferirli in tubi sterili da 50 millilitri riempiti con 50 millilitri di soluzione di biossido di cloro da 200 PPM. Capovolgere il tubo due volte e lasciarlo sterilizzare per 30 minuti.
Trasferire i campioni in una provetta da 50 millilitri riempita con 40 millilitri di PBS sterile. Dopo il lavaggio PBS, posizionare ciascun campione di pelle in un pozzetto separato di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 350 microlitri del mezzo preriscaldato in un pozzetto, mantenendo il campione all'interfaccia aria-liquido.
Sigillare le piastre a 24 pozzetti con una guarnizione a piastra permeabile al gas prima di posizionare la piastra per l'incubazione in un incubatore di tessuto umidificato al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare i campioni in 500 microlitri di PBS sterile. Rimuovere gli antibiotici residui dal campione trattandoli con terreni privi di antibiotici al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 24 ore.
Se la torbidità o l'infezione fungina si sviluppa nei mezzi privi di antibiotici, scartare il campione. Quindi, preparare un tubo da 50 millilitri con 10 millilitri di brodo di soia tripttico sterile. Quindi trasferire diverse colonie di Staphylococcus aureus da una piastra di agar fresco di S.aureus al brodo e incubare il tubo a 37 gradi Celsius e 150 RPM per 18 ore.
Dopo aver centrifugato i tubi a 4.000 G per tre minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di PBS sterile. Ripetere il lavaggio PBS due volte prima di regolare l'inoculo a 0,6 densità ottica a lunghezze d'onda di 600 nanometri utilizzando PBS sterile. Confermare il carico dell'inoculo mediante un conteggio manuale delle piastre.
Per infettare il campione di pelle, preparare una piastra fresca a 24 pozzetti con 400 microlitri di mezzi privi di antibiotici preriscaldati e aggiungere i 24 inserti del pozzetto usando una pinza sterile. Rimuovere il supporto dai campioni di pelle. Lavarli con 500 microlitri di PBS sterile e rimuovere il lavaggio.
Utilizzare una pinza sterile per tenere delicatamente il campione sul fondo del pozzetto. Utilizzare una biopsia di perforazione di quattro millimetri per perforare il campione di pelle a una profondità approssimativa di uno o due millimetri e creare un lembo centrale della ferita. Quindi utilizzare un bisturi a lama numero 15 e una pinza di tessuto Allis dai denti sterili per rimuovere lo strato superiore del lembo della ferita.
Una volta che tutti i campioni sono stati feriti, trasferirli nei 24 inserti del pozzetto usando una pinza sterile. Pipettare 15 microlitri di inoculo batterico nel letto della ferita prima di incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di tessuto umidificato. Per periodi di incubazione più lunghi, rimuovere il supporto, sostituirlo con terreni freschi ogni 24 ore e incubare le piastre nelle stesse condizioni.
Per determinare la carica batterica, rimuovere il mezzo dal fondo dei pozzetti. E usando una pinza sterile, trasferire ogni campione in un tubo separato da 50 millilitri riempito con un millilitro di PBS sterile. Quindi staccare i batteri dalla superficie del letto della ferita omogeneizzando la superficie del campione con un omogeneizzatore a punta fine.
Assicurarsi che il letto della ferita sia a diretto contatto con la punta dell'omogeneizzatore. Una volta elaborati tutti i campioni, vortice ogni campione prima di trasferire 20 microlitri di omogenato nel pozzetto corrispondente di una piastra a 96 pozzetti contenente 180 microlitri di PBS sterile. Diluire in serie ogni omogenato di campione a 1 volte 10 fino al negativo 7 e pipettare 10 microlitri di omogenato diluito su una piastra di Agar di soia triplice in triplice copia.
Incubare la piastra di Agar di soia triptica a 37 gradi Celsius e, dopo 18 ore, contare il numero di colonie per determinare le unità formanti colonie o CFU per ciascun campione. È stato identificato un adeguato regime di sterilizzazione della pelle utilizzando diversi trattamenti per periodi di tempo variabili. L'integrità dei tessuti è stata monitorata mediante istologia, seguita da colorazione con ematossilina ed eosina immediatamente dopo il trattamento.
Un trattamento di 30 minuti con biossido di cloro è stato il trattamento più efficace, con sterilizzazione riproducibile del tessuto cutaneo preservando l'integrità del tessuto. Una pellicola bianca nel letto della ferita era evidente sul tessuto 48 ore dopo l'infezione. Sebbene il modello scratch ospitasse un numero medio più elevato di CFU dopo 24 ore, la tecnica di rimozione del lembo ha prodotto risultati più coerenti.
Dopo 48 ore, circa 100 volte più CFU batteriche sono state recuperate dal tessuto ferito rispetto all'inoculo, indicando un'infezione riuscita. Le sezioni istologiche colorate di Gram del tessuto infetto indicavano la presenza di cellule S.aureus nel letto della ferita, che era assente nelle sezioni di tessuto non infetto. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire l'immunoistochimica per studiare la risposta tissutale, la colorazione di gram modificata per visualizzare la localizzazione batterica e la conta delle piastre vitali dopo l'esposizione antimicrobica per testare l'efficacia antimicrobica.
Per i ricercatori che sviluppano nuovi antimicrobici, questo modello fornirà un maggiore controllo dell'ottimizzazione del piombo, ridurrà la dipendenza da sperimentazioni costose e strettamente regolamentate sugli animali e consentirà la rapida traduzione degli antimicrobici nella clinica.
