In questo articolo, presentiamo un protocollo di ferita della pelle umana ex vivo ottimizzato che può fornire importanti dati di efficacia come parte di una pipeline traslazionale clinica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una valutazione accurata ad alto rendimento della riparazione delle ferite nella pelle umana vivente. A dimostrare la procedura saranno Elizabeth Roberts, ricercatrice post-dottorato, e Alexandria Kidd, assistente di ricerca del nostro laboratorio.
Per preparare un campione di tessuto cutaneo per la ferita, posizionare il derma cutaneo con il lato verso il basso in una capsula di Petri da 90 millimetri e utilizzare forbici sterili per rimuovere il tessuto adiposo. Quando tutto il grasso è stato rimosso, posizionare la pelle in 25 millilitri di HBSS integrati con antibiotici per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione intermittente per rimuovere qualsiasi residuo di sangue nel tessuto adiposo. Dopo 10 minuti, risciacquare la pelle in 25 millilitri di DPBS.
Dopo 10 minuti, ripetere il risciacquo HBSS senza antibiotici, quindi eseguire un risciacquo finale in 25 millilitri di DPBS. Quindi posizionare una membrana filtrante in nylon sterile sulla pila assorbente e asciugare il lato dermico della pelle su una garza sterile in una capsula di Petri da 90 millimetri per rimuovere il DPBS residuo. Posizionare il derma della pelle secca a lato verso il basso su un coperchio pulito da 90 millimetri della capsula di Petri per rimuovere eventuali DPBS residui e tamponare l'epidermide asciutta con una garza sterile fresca.
Per creare una ferita, premere un pugno biopsia di due millimetri contro la pelle tenendo la pelle stretta e torcendo delicatamente. Usando una pinza di tessuto dentato curvo, raccogli ciascun lato della ferita di circa due millimetri di diametro e aggancia le forbici dell'iride curve sotto la ferita. Utilizzare un pugno da biopsia da sei millimetri per la biopsia attorno alla ferita centrale di due millimetri per creare un impianto di sei millimetri con una ferita di due millimetri di spessore parziale al centro.
Quindi posizionare l'epidermide dell'espianto della ferita lateralmente verso l'alto sulla pila di membrana del filtro in nylon per un'incubazione da uno a sette giorni a 32-37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per la colorazione fluorescente, raccogliere gli espianti della ferita in tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di fissativo cutaneo per tubo e incubare gli espianti durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il fissativo con un millilitro di tampone di lavaggio colorante.
Dopo il lavaggio, coprire ogni campione con circa 150 microlitri di tampone bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il tampone di blocco, aggiungere 150 microlitri di anticorpi primari diluiti in tampone di blocco per tubo e incubare gli espianti della ferita durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, sciacquare i campioni con 500 microlitri di tampone di lavaggio colorante contenente 0,2% di azide di sodio seguito da tre risciacqui in tampone di lavaggio normale.
Dopo il lavaggio, aggiungere 150 microlitri di un appropriato anticorpo secondario coniugato a florescenza diluito in tampone di lavaggio colorante a ciascun pozzetaggio per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sciacquare l'espianto tre volte per 30 minuti in 500 microlitri di tampone di lavaggio colorante per lavaggio prima di contro-macchiare ogni espianto con 150 microlitri di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare l'espianto due volte per 30 minuti con 500 microlitri di tampone di lavaggio per lavaggio.
Per l'imaging di espianto, posizionare una capsula di Petri da 60 millimetri sulla piattaforma di imaging di un microscopio confocale e aggiungere uno strato di circa un millilitro di DPBS alla parabola. Utilizzare una pinna per trasferire gli espianti della ferita al piatto. Dopo aver impostato il software di imaging appropriato per l'esperimento, posizionare la ferita al centro del piano di imaging e acquisire le immagini delle biopsie della ferita.
Per eseguire l'imaging al microscopio digitale wireless per ottenere immagini di alta qualità in modo economico, collegare un telefono o un laptop a un microscopio digitale wireless. Posizionare gli espianti avvolti lateralmente su un pezzo di tessuto di laboratorio e rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo dal campione. Quindi posizionare l'espianto al centro del campo visivo del microscopio e acquisire immagini utilizzando la fotocamera collegata.
L'immunoperossidasi e l'immunofluorescenza possono essere utilizzate per la colorazione del tessuto dell'intero monte. Inoltre, la colorazione viva / morta può essere eseguita su tessuto fresco e immaginata pre o post-fissazione. La colorazione dell'intero supporto delle ferite può essere utilizzata per determinare i tassi di chiusura della ferita in modo riproducibile.
In questa analisi rappresentativa, la chiusura della ferita cutanea sana è stata osservata dopo quattro o cinque giorni, mentre le ferite cutanee diabetiche non sono riuscite a chiudersi completamente entro il periodo di analisi di sette giorni. L'espressione di K14 ha raggiunto il picco il secondo giorno nelle ferite cutanee sane prima di diminuire rapidamente con un aumento della differenziazione epidermica. Questa riepitelizzazione e la successiva differenziazione epidermica sono state ritardate nelle ferite cutanee diabetiche.
La riforma della barriera epidermica precoce esclude la penetrazione dell'anticorpo K14 all'interno degli strati epidermici differenziati. All'inizio del processo di riepitelizzazione, i cheratinociti dello strato basale K14 positivo migrano verso l'interno sopra la ferita aperta, in modo tale che l'epidermide più vicina al bordo esterno della ferita si formi prima dell'epidermide più vicina al bordo interno della ferita. Più tardi nella fase di riparazione, la colorazione K14 viene persa poiché l'epidermide si differenzia dall'esterno verso l'interno.
La colorazione dell'intero monte può anche essere utilizzata per studiare l'espressione e la localizzazione di altri marcatori rilevanti della ferita nella pelle, nonché la presenza di cellule immunitarie di interesse nel sito della ferita in diverse fasi di guarigione. Generare ferite escissionali riproducibili può essere difficile all'inizio. Consigliamo di praticare la procedura di ferimento utilizzando la pelle in eccesso.
