Il nostro protocollo è un metodo in vivo per studiare le funzioni autonome delle cellule di FMRP durante lo sviluppo. Questo può aiutare a comprendere la fisiopatologia specifica del tipo di cellula della sindrome dell'X fragile. Questo metodo impiega l'elettroporazione specifica dello stadio, del sito e della direzione di un sistema vettoriale inducibile da farmaci contenente l'RNA a forcina Fmr1.
Con questo metodo, otteniamo il knockdown selettivo FMRP nel circuito uditivo. Questo metodo può anche essere applicato per studiare la funzione di altri geni nel circuito uditivo o nel sistema vestibolare. Inizia posizionando le uova orizzontalmente per posizionare l'embrione sulla parte superiore dell'uovo per una facile manipolazione.
Incubare a 38 gradi Celsius per 46-48 ore fino a Hamburger e Hamilton, o stadio HH 12, per la trasfezione del tubo neurale o per 54-56 ore fino a HH 13 per la trasfezione di otocisti . Rimuovere le uova dall'incubatrice, una dozzina di uova alla volta. Tenere le uova fuori dalla loro incubatrice per più di un'ora introduce variazioni di sviluppo e riduce la vitalità.
Usa una torcia per proiettare luce dal fondo dell'uovo. La posizione dell'embrione appare come un'area scura sul guscio d'uovo. Segna la posizione dell'embrione sul guscio d'uovo con una matita.
Pulire le uova con una garza contenente il 75% di etanolo e praticare un foro nell'estremità appuntita delle uova usando la punta delle forbici. Quindi, rimuovere due millilitri di albumina con una siringa ad ago da 18 gauge. Assicurarsi che il foro sia abbastanza grande da consentire l'inserimento dell'ago.
Pulire via l'albumina che perde con una garza e sigillare il foro con nastro trasparente. Coprire la parte superiore delle uova con nastro trasparente, centrando l'area scura segnata dalla matita per ridurre al minimo le crepe e prevenire la caduta di detriti di guscio durante la finestratura. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con una garza contenente il 75% di etanolo e pulire l'area coperta di nastro con il 75% di etanolo.
Usa un piccolo paio di forbici per tagliare una finestra da uno a due centimetri quadrati attorno alla circonferenza del segno della matita. Tenere le forbici piatte per evitare di danneggiare l'embrione sottostante. Posizionare l'uovo finestrato sotto uno stereomicroscopio con un oculare 10X e zoom 2X.
Riempire una siringa da un millilitro con la soluzione di inchiostro e quindi montare un ago da 27 gauge. Piegare l'ago con un angolo di 45 gradi con una pinza. Sotto il microscopio, colpire con attenzione dal bordo dell'area opaqua e inserire l'ago sotto l'embrione.
Iniettare circa 50 microlitri di inchiostro, che si diffonderà sotto l'area pellucida, per la visualizzazione dell'embrione. L'inchiostro formerà uno sfondo scuro per la chiara visualizzazione dell'embrione. Tirare i capillari di vetro nelle pipette usando un estrattore di pipette.
Sotto un microscopio da dissezione, aprire con attenzione la punta dell'ago capillare a 10-20 micrometri di diametro con una pinza. Conservare le pipette in una scatola fino all'uso. Quindi, riempire una pipetta capillare con 0,5-1 microlitro della miscela plasmidica applicando una pressione negativa attraverso un tubo di gomma all'estremità della pipetta con una siringa.
Metti l'uovo al microscopio in modo che l'embrione sia orientato verticalmente con la coda vicino a te. Tenere la pipetta capillare con una mano o con il manipolatore a tre assi e guidare la punta della pipetta sul rombomero da 5 a 6. in una direzione da coda a testa.
Colpire delicatamente la punta attraverso la membrana vitellina e nel tubo neurale dorsale, quindi ritirare leggermente la pipetta in modo che la punta sia nel lume del tubo neurale. Iniettare la miscela plasmidica applicando la pressione dell'aria fino a quando il plasmide colorato si diffonde completamente nei rombomeri da 5 a 6 e si estende nei rombomeri 3 e rombomeri 4. Verificare la riuscita dell'iniezione, che si ottiene quando la soluzione plasmidica blu si diffonde rapidamente lungo il tubo neurale senza perdite.
Quando si verifica una perdita, il blu svanisce rapidamente. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare un elettrodo bipolare di platino su entrambi i lati del tubo neurale. Eroga due impulsi di 12 volt e una durata di 50 millisecondi con un elettroporatore.
Osservare le bolle d'aria alle estremità dell'elettrodo bipolare, con più sul lato negativo. Verificare la corretta elettroporazione, che si ottiene quando la miscela plasmidica colorata entra nel tessuto del tubo neurale vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere con attenzione l'elettrodo bipolare.
Coprire la finestra sul guscio d'uovo con un pezzo di pellicola trasparente pretagliata a quadrati da due pollici e spruzzata con etanolo al 75%. Rimetti l'uovo nella sua incubatrice. Pulire l'elettrodo bipolare erogando da 10 a 20 impulsi di 12 volt e 50 millisecondi di durata in soluzione salina prima di procedere all'uovo successivo.
Sotto il microscopio, posiziona l'uovo in modo tale che l'embrione sia verticale con la coda vicino a te. Tenere la pipetta capillare e colpire delicatamente l'otocisti destra in direzione dorsolaterale. Iniettare la miscela plasmidica con pressione dell'aria fino a quando l'otocisti è riempita con soluzione blu.
Verificare la riuscita dell'iniezione, che si ottiene quando la miscela di plasmide blu è confinata all'interno dell'otocisti e non fuoriesce. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare l'elettrodo bipolare sull'otocisti e posizionare rispettivamente i lati positivo e negativo anteriore e posteriore all'otocisti. Erogare due impulsi di 12 volt e 50 millisecondi con l'elettroporatore.
Verificare la corretta elettroporazione, che si ottiene quando la miscela di plasmidi blu entra nel tessuto dell'otocisti vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere con attenzione l'elettrodo bipolare e coprire la finestra sul guscio d'uovo con un film trasparente. Infine, restituire l'uovo all'incubatrice.
L'immagine rappresentativa mostra un esempio di terzo giorno embrionale, o E3, dopo la trasfezione del tubo neurologico e il trattamento dox al secondo giorno embrionale, o E2. Le cellule trasfettate con Fmr1 shRNA e EGFP sulla sezione trasversale sono mostrate qui. Le cellule che esprimono EGFP erano confinate a un lato del tubo neurale e del tronco cerebrale. Una sezione trasversale a E15 con nucleo magnocellularis che esprime EGFP, o neuroni NM, sul lato trasfettato è mostrata qui.
Sul lato controlaterale, assoni contenenti EGFP sono stati osservati nella porzione ventrale del nucleo laminaris, o NL. L'effetto knockdown dello shRNA Fmr1 è stato convalidato da marcate riduzioni dell'immunoreattività FMRP nei neuroni NM trasfettati rispetto ai neuroni vicini non trasfettati. Il ganglio uditivo a E19 con immunoreattività FMRP è mostrato qui. I neuroni gangliari uditivi non sono stati trasfettati.
Alcune cellule gliali derivate dalle cellule della cresta neurale cranica sono state trasfettate. Le immagini rappresentative mostrano l'abbattimento della FMRP nel dotto uditivo dopo la trasfezione dell'otocisti. I condotti uditivi all'E9 hanno mostrato un'ampia fluorescenza EGFP.
Sulle sezioni trasversali, le cellule che esprimono EGFP erano localizzate nella papilla basilare e nel ganglio uditivo. L'effetto knockdown dello shRNA Fmr1 è stato convalidato dalla ridotta immunoreattività FMRP nelle cellule ciliate trasfettate rispetto alle cellule ciliate vicine non trasfettate. Allo stesso modo, l'immunoreattività FMRP era ampiamente diminuita nei neuroni gangliari uditivi trasfettati.
La proiezione centrale dei neuroni gangliari uditivi trasfettati è stata tracciata al tronco cerebrale attraverso il nervo uditivo con terminali terminali caratterizzati. Durante il tentativo di questa procedura, la cosa più importante è controllare il sito e la direzione dell'elettroporazione per la trasfezione selettiva. Seguendo questa procedura, il riempimento di un singolo tipo di cellula, l'immunocolorazione, la selezione cellulare seguita dallo spettro di massa o il sequenziamento di singole cellule possono essere eseguiti per rivelare i cambiamenti a livello morfologico e biochimico.
Questa tecnica consente anche l'editing selettivo di altri geni con controllo temporale e specificità dei componenti nell'orecchio uditivo per i circuiti staminali e può essere modificata per manipolare il sistema vestibolare.
