Questo lavoro è stato finanziato attraverso un NIH R15 AREA concedere a John Horne (NIMH; R15MH083221).

1. Embrioni transgenici <ol><li> Qui si sta utilizzando una linea transgenica di zebrafish creata attraverso un trasposone-mediata metodo trappola potenziatore 8. L&#39;inserto transgenico comprende due sequenze codificanti: KalTA4, un pesce zebra versione ottimizzata del GAL4 attivatore trascrizionale, e la proteina fluorescente rossa, mCherry. La trappola enhancer rendimenti metodo linee di zebrafish transgenici che esprimono questa cassetta transgenici sotto il controllo di una sequenza endogena enhancer. Così, a seconda della identità della specifica sequenza enhancer, espressione di entrambi KalTA4 e mCherry è localizzata a specifiche regioni del cervello di sviluppo. Per la Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 linea che stiamo usando qui, l&#39;espressione è localizzata a vari siti nel romboencefalo, proencefalo, e, di particolare importanza, il bulbo olfattivo 8 (vedi anche Fig. 1). . Dato questo modello di espressione e la localizzazione della cassetta all&#39;interno del genoma, i transgeni si prevede di essere sotto il controllo del promotore zic4 8 (vedi anche <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimaging / lines_distel / main</a> .). </li><li> Et adulti (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 pesce eterozigote per l&#39;inserto transgenici sono in genere accoppiati con WT (AB) di pesce, portando a circa il 50% prole transgenica. (Per una maggiore percentuale di prole transgenica, due eterozigoti possono essere accoppiati.) </li><li> Al fine di bloccare la formazione di pigmento e facilitare l&#39;imaging a fluorescenza, trattare gli embrioni transgenici con 100 mM N-phenylthiourea (PTU) inizio a 6-8 HPF. </li></ol> 2. Embrioni di montaggio <ol><li> A HPF 24-28, il trasferimento degli embrioni all&#39;acqua uovo senza PTU. Identificare gli embrioni transgenici per l&#39;espressione di mCherry utilizzando un microscopio a fluorescenza. Rimuovere la membrana corionica da embrioni transgenici con una pinza sottile. Trasferimento degli embrioni liberati dalla loro corion ad una piastra di Petri contenente tampone elettroporazione, più 0,02% tricaine [Buffer elettroporazione: 180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 HEPES mM, pH 7,2] 4. Lasciare 2 minuti per l&#39;anestetico abbia effetto prima di procedere alla fase di montaggio. </li><li> Preparare una soluzione allo 0,5% a basso punto di fusione agarosio in tampone elettroporazione più tricaine dal microonde la soluzione, e poi mettendo la soluzione in un 34-37 ° C incubatore. Una volta che la temperatura della soluzione di agarosio è equilibrato, posto una grossa goccia (~ 500 microlitri) della soluzione di agarosio al centro di un piatto di 60 millimetri di Petri. Aggiungere 6-8 embrioni anestetizzati a questa goccia di agarosio. </li><li> Utilizzando una pinza sottile (o le estremità multa di punte taglio pipetta microloader), posizione che gli embrioni in modo che essi sono tutti rivolti nella stessa direzione e allineati in una fila verticale. Per solidificare l&#39;agarosio, e intrappolare gli embrioni in posizione, porre la capsula su un grande piatto di Petri con 2-3 mm di ghiaccio. </li><li> Una volta che l&#39;agarosio si è solidificato, inondare il piatto con elettroporazione tampone più tricaine, assicurando che la soluzione copre completamente il calo solidificato agarosio. </li></ol> 3. Micro-iniezione di espressione del DNA plasmidico <ol><li> Preparare il plasmide di espressione GFP utilizzando un kit midi o maxi-prep isolamento plasmide (ad esempio, Qiagen). Sospendere il plasmide ad una concentrazione finale di 0,5 mg / mL in acqua sterile, più 0,03% rosso fenolo. Per l&#39;esperimento bulbo olfattivo targeting qui descritti, stiamo usando una espressione plasmide con la sequenza codificante del EGFP sotto il controllo di più GAL4 siti di legame (14 tandem sequenze UAS e il promotore di pesce basale, E1b). Usando questo plasmide, solo le cellule che esprimono il transgenically KalTA4 fattore di trascrizione sarà in grado di esprimere la GFP, così, mediando espressione mirata di GFP. Nota: qui stiamo usando rosso fenolo per la visualizzazione delle iniezioni di DNA, che dovrebbero essere applicabili per il targeting altre regioni del cervello in sviluppo, a condizione che la regione si può accedere dai ventricoli. Per il targeting di altri tipi di cellule che richiedono la visualizzazione fluorescente, Bodipy o Quantam coloranti Dot potrebbe potenzialmente essere usato per visualizzare le iniezioni sotto illuminazione fluorescente. </li><li> Pipette microiniezione possono essere fabbricati utilizzando un estrattore pipetta orizzontale o verticale. Regolazioni di calore e pull-resistenza varia a seconda del tipo di estrattore, il tipo di elemento riscaldante, e il tipo di tubi di vetro capillari. Utilizzando un P-30 Sutter estrattore verticale, utilizzare un ambiente di calore di 980 e un divano-force di 960 per produrre lunghe, affusolate, pipette nitide da sottili pareti di vetro borosilicato capillare con filamenti [strumento Sutter # BF100-78-10]. Pipette Microinjetion tirato con queste impostazioni sono sigillate e devono essere rotto di nuovo prima dell&#39;iniezione. </li><li> Utilizzare un puntale microloader per aggiungere 1-2 ml di soluzione di DNA plasmidico alla pipetta di iniezione. </li><li> Montare eassicurare la pipetta caricata nel supporto pressione pipetta di iniezione del sistema. </li><li> Rompere di nuovo la pipetta caricato con una pinza sottile fino a produrre impulsi di pressione rilascio sbuffo della soluzione di DNA rosso. In alternativa, suggerimenti possono essere rotto di nuovo da rapidamente penetrare in un sommerso, Kimwipe piegato laboratorio. Nota: perché le pipette di iniezione sono inizialmente sigillata e deve essere manualmente rotto di nuovo, la dimensione della punta e il volume di iniezione sono variabili. Pipette di iniezione ideale dovrebbe richiedere 3-5 impulsi di iniezione per riempire completamente il ventricolo proencefalo sviluppo di 24 embrioni HPF (100 ms impulsi di iniezione a 40 psi). </li><li> Iniettare la soluzione plasmide DNA nei ventricoli del cervello sviluppare tale che il DNA è costretto adiacente, e intercalate in, la regione del cervello destinata a formare il bulbo olfattivo. Il bulbo olfattivo è derivato dalle cellule della parete più anteriore del ventricolo proencefalo. Così, inserendo la pipetta di iniezione nei ventricoli in modo tale che la pipetta punta verso l&#39;estremità anteriore del cervello di sviluppo, le forze di pressione di iniezione del DNA e nella adiacente al bulbo olfattivo potenziali. Iniettare DNA fino colorante rosso è ben visibile alla fine anteriore del ventricolo proencefalo. Perché il DNA comincia a diffondere immediatamente, diluendo il DNA, è importante procedere alla fase elettroporazione il più presto possibile dopo l&#39;iniezione (ad esempio, entro 10 sec). </li></ol> 4. Elettroporazione <ol><li> Elettroporazione viene effettuato con auto-costruito elettrodi in elettrodi di platino Grass ipodermico (Grass Tecnologia # E2). Gli elettrodi sono collegati a un portatile sonda e la distanza finale tra gli elettrodi di platino deve essere di 1 mm (per i dettagli sulla costruzione v. 9). Onda quadra impulsi elettroporazione sono prodotti collegando gli elettrodi ad una SD-9 stimolatore Grass (erba Technology, modello SD-9). </li><li> Impostare la SD-9 stimolatore per produrre singole, 5 impulsi di elettroporazione ms a 70 volt. Posizionare gli elettrodi in modo che l&#39;elettrodo positivo è posizionato adiacente alla estremità anteriore dell&#39;embrione, mentre l&#39;elettrodo negativo è posteriore alla testa dell&#39;embrione. Avviare manualmente ~ 7-8 impulsi di elettroporazione con l&#39;interruttore singolo modalità dello stimolatore-9 SD, separando ogni impulso da ~ 1 sec. Tensioni appropriato varierà a seconda dell&#39;età degli embrioni e la sorgente di tensione utilizzati. Giovane embrioni richiedono tensioni più basse per evitare danni all&#39;embrione, mentre vecchi embrioni richiedono alte tensioni di avviare elettroporazione 7. </li><li> Lasciare gli embrioni di recuperare per almeno 10 minuti dopo l&#39;elettroporazione prima liberandoli dalla agarosio. </li><li> Utilizzando una pinza sottile, senza gli embrioni dal agarosio delicatamente tracciare il contorno degli embrioni evitando il contatto reale con gli stessi embrioni. </li><li> Una volta liberato, tornare gli embrioni di acqua uovo (con PTU se necessario). Tenerli a 28 ° C fino a che non devono essere ripreso per l&#39;espressione della GFP. </li></ol> 5. Embrioni di montaggio per l&#39;imaging <ol><li> Trasferimento degli embrioni da acqua uovo più PTU all&#39;acqua uovo, più 0,02% tricaine. Lasciare qualche minuto per l&#39;anestetico abbia effetto prima di procedere alla fase di montaggio. </li><li> Preparare una soluzione allo 0,5% a basso punto di fusione agarosio nell&#39;uovo acqua più tricaine dal microonde la soluzione, e poi mettendo la soluzione in un 34-37 ° C incubatore. Una volta che la temperatura della soluzione di agarosio è equilibrato, posto una grossa goccia (~ 300 ul) della soluzione di agarosio al centro di un piatto di 35 millimetri di Petri. Aggiungi un embrione anestetizzati a questa goccia di agarosio. </li><li> Utilizzando una pinza sottile (o le estremità multa di punte taglio pipetta microloader), posizione che gli embrioni in modo che siano in posizione verticale, rendendo possibile visualizzare una vista dorsale di sviluppo del cervello con un microscopio verticale (ambiti invertita richiederà una diversa geometria embrione, e un piatto diverso consentendo la visualizzazione dal basso, vedi 12). Solidificare l&#39;agarosio mettendo il piatto su un grande piatto di Petri con 2-3 mm di ghiaccio. Ri-orientamento con una pinza sottile sarà probabilmente richiesto durante la solidificazione di assicurare che l&#39;embrione non possa cadere su un lato. </li><li> Una volta che l&#39;agarosio si è solidificato, inondare il piatto con l&#39;uovo l&#39;acqua più tricaine garantire che la soluzione copre completamente il calo solidificato agarosio. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Anche se l&#39;espressione GFP può essere osservato a partire da 6 ore dopo l&#39;elettroporazione, qui ci stanno mostrando le immagini da un embrione 4 giorni dopo l&#39;elettroporazione in modo tale che la struttura dei neuriti delle cellule bersaglio è sufficientemente sviluppata. L&#39;Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenici linea trappola potenziatore visualizza espressione costitutiva di mCherry (e KalTA4) nel romboencefalo, cervelletto, proencefalo e nel bulbo olfattivo embrioni a 5 giorni dopo la fecondazione (Fig. 1A e 1C). Gli embrioni che hanno avuto un UAS-GFP plasmide di espressione incorporato mediante elettroporazione mirati (come descritto sopra), espressione di GFP dimostrano che è limitata alle cellule del bulbo olfattivo sviluppo (Fig. 1B, 1D e 1E). Transgenically solo le cellule che esprimono il fattore di trascrizione KalTA4 sono in grado di attivare l&#39;espressione di questo SUP-GFP plasmide. L&#39;incorporazione di questo plasmide in non transgenici embrioni non porta a qualsiasi espressione GFP rilevabile. Quindi, è l&#39;azione combinata di elettroporazione mirata di UAS-GFP e localizzati espressione transgenica del driver KalTA4 che conduce alla espressione esclusiva di GFP nelle cellule del bulbo olfattivo sviluppo. Le cellule che esprimono GFP tipico spettacolo proiezioni assonali delle cellule bulbo olfattivo mitralico (Fig. 1B e 1D) 10. Al fine di visualizzare le proiezioni degli assoni, le immagini in figura 1B e 1D dovevano essere esposti ad alti livelli tali che la regione di corpi cellulari erano ben sovraesposta. Un livello inferiore di esposizione (Fig. 1E) mostra che i corpi delle cellule che esprimono GFP sono infatti localizzate nel bulbo olfattivo (cfr. Fig. 1C e 1E;. Linea grigia segna il confine del bulbo olfattivo). <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Mirate espressione GFP nel bulbo olfattivo di un embrione 5 dpf zebrafish. L&#39;Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenici linea trappola enhancer, display espressione costitutiva del mCherry nel cervelletto romboencefalo,, proencefalo, e bulbo olfattivo (A e C, mCherry fluorescenza mostrato in rosso). Questa espressione di mCherry è mediata da transgenico GAL4-espressione. Gli embrioni che sono stati elettroporate con un UAS-GFP vettore di espressione a 28 HPF, display espressione GFP mirati nel bulbo olfattivo a 5 giorni dopo la fecondazione (B, D ed E, GFP fluorescenza visualizzato in verde. Embrione Come in A e C). Un&#39;immagine di esposizione più bassi in fondo (E) mostra che l&#39;espressione di GFP è limitato a corpi cellulari del bulbo olfattivo. La linea grigia indica il confine del bulbo olfattivo. Campo chiaro (scala di grigi), fluorescenza verde (verde), e fluorescenza rossa (rosso) le immagini erano tutti prendere con un microscopio a fluorescenza Olympus BX60.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui abbiamo descritto un metodo in elettroporazione in vivo in zebrafish che utilizza un potenziatore trappola GAL4 linea transgenica di indirizzare l&#39;espressione del transgene elettroporate ad una popolazione di cellule nel bulbo olfattivo sviluppo. Questo approccio combina l&#39;eccellente risoluzione temporale di elettroporazione in vivo 7 con la cellula-tipo specifica espressione mediata da potenziatore trappola linee transgeniche 8. Anche se qui abbiamo descritto gli attacchi del bulbo olfattivo, in elettroporazione in vivo possono essere utilizzati per indirizzare altre regioni del sistema nervoso 2-7, e le linee enhancer trap sono disponibili con l&#39;espressione mirata di GAL4 in molti diversi tipi di cellule o tessuti specifici 8, 11. Naturalmente, questa tecnica di elettroporazione dovrebbe anche essere adatto per altri approcci combinatioral genetiche come il Lexa o Tet sistemi 13, 14, 15. Uno dei principali vantaggi di elettroporazione è che non c&#39;è bisogno di fare ulteriori linee transgeniche, dato che un adeguato GAL4-line è disponibile. Ciò consente di risparmiare sei mesi. Elettroporazione in vivo permette l&#39;incorporazione di oligonucleotidi in neuroni e dei loro precursori in qualsiasi fase specifica di sviluppo dei sistemi nervosi è di interesse 7. La risoluzione temporale è particolarmente vantaggioso per la perdita di funzione di analisi, perché può aggirare problemi di targeting dei geni che hanno funzioni essenziali nelle fasi precedenti dello sviluppo. Il metodo che descriviamo qui può anche essere utilizzato per integrare la perdita di funzione tra oligonucleotidi reagenti RNAi o costrutti e morfolino oligonucleotidi anti-senso 4, 7. Plasmide-driven reagenti come plasmidi proteina dominante negativo di espressione o di breve tornante plasmidi RNAi può anche essere posta sotto controllo di un GAL4 UAS, consentendo per il tipo specifico di cellule precisa espressione che abbiamo mostrato qui per l&#39;espressione di GFP.

Reagenti: <ul><li> Agarosio a basso punto di fusione (Sigma, A9414) </li><li> Plasmide kit midi o maxi-prep (ad esempio Qiagen, # 12643] </li><li> Rosso fenolo (Sigma, P3532) </li></ul> Attrezzatura: <ul><li> Capillare di vetro con filamento; ID = 0.78 mm, OD = 1,0 mm (Sutter Instruments, # BF100-78-10) </li><li> Erba SD-9 stimolatore (Grass Technology, modello SD-9) </li><li> Erba elettrodi di platino ipodermico, ago dritto (Tecnologia Grass, # E2) </li><li> Micro-loader puntali (Eppendorf, # X22703R) </li><li> Pipettare estrattore (ad esempio Sutter, modello P-30) </li><li> Pipettare estrattore (ad esempio Sutter, modello P-30) </li></ul>

targeting olfactory bulb neurons using combined in vivo electroporation and gal4-based enhancer trap zebrafish lines

Elettroporazione in vivo è un metodo potente per la consegna di plasmidi di espressione del DNA, reagenti RNAi, e morfolino oligonucleotidi anti-senso a specifiche regioni di embrioni sviluppo, compresi quelli di C. elegans, pulcino, Xenopus, pesce zebra e un mouse 1. In zebrafish, elettroporazione in vivo ha dimostrato di avere un&#39;ottima risoluzione spaziale e temporale per la consegna di questi reagenti 2-7. La risoluzione temporale di questo metodo è importante perché permette di incorporazione di questi reagenti in determinate fasi dello sviluppo. Inoltre, poiché l&#39;espressione da vettori elettroporate si verifica entro 6 ore 7, questo metodo è più attuale che si avvicina transgenici. Mentre la risoluzione spaziale può essere estremamente precisi quando mira una singola cella 2, 6, è spesso preferibile incorporare i reagenti in una popolazione di cellule specifiche all&#39;interno di un tessuto o struttura. Quando ci si rivolge più celle, in elettroporazione in vivo è efficiente per la consegna ad una regione specifica di un embrione, ma in particolare nel sistema nervoso, è difficile bersaglio specifici tipi cellulari esclusivamente attraverso elettroporazione spazialmente discreto. In alternativa, enhancer trappola linee transgeniche offrono eccellenti cellule tipo-specifici espressione dei transgeni 8. Qui si descrive un approccio che combina transgenici GAL4 trappola a base di linee enhancer 8 con spazialmente discreto elettroporazione in vivo 7, 9 per indirizzare specificatamente lo sviluppo dei neuroni del bulbo olfattivo zebrafish. L&#39;Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 (ex GA80_9) linea trappola enhancer precedentemente descritti 8, mostra mirata espressione transgenica di mCherry mediata da un pesce zebra ottimizzato GAL4 (KalTA4) attivatore trascrizionale in più regioni del cervello di sviluppo, compresi rombencefalo, cervelletto, proencefalo, e il bulbo olfattivo. Per obiettivo espressione GFP appositamente per il bulbo olfattivo, un plasmide con la sequenza codificante del GFP sotto il controllo di più GAL4 siti di legame (SUP) è stato elettroporate nella estremità anteriore del proencefalo in 24-28 ore dopo la fecondazione (HPF). Anche se questo metodo incorpora DNA plasmidico in più zone del prosencefalo, l&#39;espressione della GFP è indotta nelle cellule che esprimono il transgenically KalTA4 fattore di trascrizione. Quindi, utilizzando la GA080_9 linea transgenica, questo approccio ha portato alla espressione di GFP esclusivamente nel bulbo olfattivo sviluppo. Cellule che esprimono GFP mirati attraverso questo approccio ha mostrato tipico proiezioni assonale, come precedentemente descritto per le cellule mitrali del bulbo olfattivo 10. Questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per la somministrazione mirata di altri reagenti tra cui a breve tornante plasmidi di espressione interferenza dell&#39;RNA, che forniscono un metodo per spazialmente e temporalmente discreta perdita di funzione di analisi.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

La risoluzione temporale e spaziale di manipolazioni genetiche determina lo spettro di fenomeni biologici che possono turbare. Qui usiamo temporalmente e spazialmente discreto<em&gt; In vivo</em&gt; Elettroporazione, combinate con linee transgeniche di zebrafish, per indurre l&#39;espressione di un transgene GFP specificatamente nei neuroni del bulbo olfattivo sviluppo.

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

12.0K Views.  Pace University. La risoluzione temporale e spaziale di manipolazioni genetiche determina lo spettro di fenomeni biologici che possono turbare. Qui usiamo temporalmente e spazialmente discreto In vivo Elettroporazione, combinate con linee transgeniche di zebrafish, per indurre l'espressione di un transgene GFP specificatamente nei neuroni del bulbo olfattivo sviluppo.

Video: Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Mappatura e applicazione di Enhancer-trappola Espressione Flippase in larvali e adulti Drosophila SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

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Neuroscienze

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Le attività di imaging Odore-Evocati nel bulbo olfattivo del mouse utilizzando riflettanza ottica e segnali autofluorescenza

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...