Name: in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
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Ringraziamo i dottori. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria e la signora Ximena Optiz-Araya per l&#39;assistenza iniziale con il set-up del protocollo e per la fornitura di plasmidi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NIH / NIDCD DC013841 (JTS).

Tutte le procedure sono state approvate dai comitati di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell&#39;Università Northwestern e sono stati eseguiti in conformità alle istruzioni nazionali di istruzione per la cura e l&#39;uso degli animali da laboratorio. 1. Gestione dell&#39;uovo <ol><li> Acquistate uova fecondate da un venditore locale. Conservare le uova a 13 ° C in frigorifero per non più di 5 giorni prima dell&#39;incubazione. La vitalità dell&#39;embrione diminuisce significativamente dopo una settimana. </li><li> Girare ogni uovo con il 70% di etanolo prima di impostare nell&#39;incubatrice. </li><li> Impostare 1-2 dozzine di uova sui loro lati in un incubatore con la temperatura impostata a 38 ° C a ~ 50% di umidità. Ciò garantisce rispettivamente il posizionamento appropriato dell&#39;embrione per l&#39;elettroporazione e la resistenza ottimale. NOTA: Dopo 48-52 h di incubazione, le uova saranno a Hamburger-Hamilton (HH) stadio ~ 12-13 e pronte per l&#39;elettroporazione. </li></ol> 2. Preparazione <ol><li> Plasmide Mixing <ol><li> Aggiungere 1 μl di 0,1% verde veloce (0,1% in 18 MΩ deionizzati e distillati H 2 O [ddH 2 O]) per ogni 7 μL di miscela DNA. </li><li> Per la co-elettroporazione di plasmidi multipli, mescolare i plasmidi in un rapporto 1: 1. La concentrazione finale del DNA dovrebbe essere di 5-8 μg / μL. </li></ol></li><li> Riempire la pipetta di iniezione <ol><li> Tirare pipette su un estrattore a micropipetti. Riempire la pipetta con 1-2 μL di plasmidi utilizzando un ago 28G a siringa. </li><li> Piegare la punta della pipetta a 10 - 20 μm utilizzando le pinze. Utilizzare un microscopio per aiutare a determinare la dimensione della punta pipetta rotta. Fissare la pipetta sul supporto della pipetta del picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. Windowing NOTA: La procedura di finitura è stata pubblicata prima del 13 . Per ulteriori informazioni visive, vedere il riferimento 13. <ol><li> Pulire tutti gli strumenti e l&#39;area di lavoro con il 70%etanolo. </li><li> Prendere il numero desiderato di uova impostate dall&#39;incubatrice (tra 6-10), lasciare a temperatura ambiente e nuovamente sostituire le uova con il 70% di etanolo. Le uova rimangono vitali per almeno 2 ore dopo la rimozione dell&#39;incubatrice. </li><li> Posizionare l&#39;uovo in cima ad un illuminatore luminoso per identificare il posizionamento degli embrioni. Cerchi il centro della zona oscura ( cioè , embrione) con una matita. </li><li> Usando un ago da 19G, pungere un buco nella fine punta dell&#39;uovo. </li><li> Punta un altro foro vicino al cerchio disegnato sul lato appuntito dell&#39;uovo. Rimuovere un piccolo pezzo del guscio d&#39;uovo esterno (circa 16 mm 2 ) con l&#39;ago 19G e quindi rimuovere un piccolo pezzo di guscio d&#39;uovo interno (circa 8 mm 2 ) con le pinze. </li><li> Con una siringa da 3 ml dotata di ago da 19G, prelevare 1,5-2,5 ml di albumina dall&#39;uovo attraverso il foro a punta. Assicurarsi di inclinare l&#39;ago a 45 °. </li><li> Coprire il foro a punta aperta con un piccolo pezzo di nastro (1 cm x 1 cm). Coprire il cerchio disegnato aD il secondo foro con nastro (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Con forbici curve (bordo di taglio = 2,5 cm), tagliare una finestra all&#39;interno del cerchio. Forbici devono essere parallele al guscio d&#39;uovo e il diametro della finestra dovrebbe essere inferiore a 2 cm. </li></ol> 4. Iniezione del plasmide <ol><li> Accendere il picospritzer. Impostare la pressione a 18 psi e la durata a 5 μs. Accendere il serbatoio dell&#39;aria e la lampada per il microscopio di dissezione. </li><li> Preparare una soluzione di 30 ml di una diluizione 1:10 di inchiostro indiano acquistato in negozio mescolato in soluzione salina fosfata tamponata sterile (PBS). Conservare a 4 ° C. L&#39;iniezione dell&#39;inchiostro indiano è un passo importante per ottenere una migliore visualizzazione dell&#39;embrione di pollo. <ol><li> Riempire una siringa da 1 ml con la soluzione di inchiostro indiana diluita. Fissare un ago 27G ed espellere tutte le bolle presenti nella siringa. </li><li> Inserisci l&#39;ago appena sotto la membrana di tuorlo ~ 2 - 3 mm dall&#39;embrione e inietta ~ 0,2 ml di inchiostro indiano delicatamente sotto l&#39;embrione. FareNon iniettare più di 0,5 ml dell&#39;inchiostro indiano in quanto potrebbe diminuire la sopravvivenza dell&#39;embrione. </li></ol></li><li> Posizionare l&#39;uovo finestra su un supporto di uova sotto il microscopio di dissezione. Utilizzate l&#39;ingrandimento più elevato per ottenere una migliore visualizzazione del sito di iniezione del plasmide. </li><li> Usando le pinze, rimuovere la membrana nell&#39;area di iniezione. Le regioni di interesse cerebrale uditivo di interesse (NM, NL) derivano dai Rhombomers 5 e 6 (R5 / R6). R5 / R6 si trovano adiacenti agli otocisti (una struttura embrionale in vertebrati che si sviluppa nell&#39;orecchio interno) che servono da punto di riferimento per le iniezioni di plasmidi R5 / R6. </li><li> Abbassare la pipetta riempita di DNA nel tubo neurale sovrastante la regione R5 / R6 e tra gli otociti usando il micromanipolatore. Uno schema di posizionamento ideale è mostrato in Figura 1A . </li><li> Applicare la pressione dell&#39;aria (18 psi, 5 μs di durata) dal picospritzer per espellere il DNA nel tubo neurale. </li></ol> 5. Elettroporazione <ol><li> Accendere tStimolatore corrente / tensione. </li><li> Riempire una siringa da 3 ml con PBS e fissare il filtro della siringa. Aggiungere 1-2 gocce di PBS sull&#39;embrione. </li><li> Abbassare l&#39;elettrodo bipolare sull&#39;embrione utilizzando il micromanipolatore con l&#39;elettrodo negativo sopra il sito di iniezione (mediale) e l&#39;elettrodo positivo lateralmente all&#39;R5 / R6 ( Figura 1A ). Evitare il contatto diretto con l&#39;embrione. Usare elettrodi bipolari in cui il materiale dell&#39;elettrodo è iridio di platino. Regolare la distanza tra le punte a 0,5 mm con le pinze. </li><li> Usando uno stimolatore di corrente / tensione, impulsi 20 volte a 50 V per 1 ms a intervalli di 1 s. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione, aggiungere una goccia di PBS sopra l&#39;area esposta. Rimuovere delicatamente l&#39;elettrodo e pulirlo con un tessuto di laboratorio e il 70% di etanolo. Chiudere la finestra che espone l&#39;embrione con nastro. </li><li> Etichetta guscio d&#39;uovo con il tipo di plasmide iniettato e la data di apertura. </li><li> Riporre le uova in incubatore con il lato rivolto verso l&#39;alto. Incubare a 38 ° C con 50% Di umidità fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata. </li><li> Se un vettore tet-on è elettroporato per il controllo temporale dell&#39;espressione genica, applicare Doxycycline (Dox) ogni 24 h per indurre l&#39;espressione del gene (vedere Sezione 6). </li></ol> 6. Sistema Tet-on per il controllo temporale dell&#39;espressione di geni <ol><li> Utilizzare i seguenti plasmidi: PCAGGS-T2TP: un plasmide esprimente di transposasi. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: un plasmide che esprime in modo stabile la proteina legante Dox. PT2K-BI-TRE-EGFP: un plasmide che contiene un promotore bidirezionale di tet-on (TRE) -dirivante espressione del reporter di EGFP e di un secondo gene di interesse. NOTA: i tre plasmidi di cui sopra devono essere co-elettroporati in un rapporto 1: 1: 1. </li><li> Preparazione della soluzione di base: <ol><li> Sciogliere Dox in PBS sterile per produrre una soluzione di stock di 1 mg / ml. Conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Applicazione Dox: <ol><li> Per indurre l&#39;espressioneN del gene di interesse durante alcune fasi di sviluppo, applicare Dox ogni 24 h. </li><li> Quando si applica Dox, prelevare l&#39;uovo, aprire la finestra, pipettare 50 μL Dox sulla membrana chorioallointoica, chiudere la finestra e mettere l&#39;uovo in incubatore. </li></ol></li></ol> 7. Preparazione dell&#39;area di dissection per le fette del Brainstem NOTA: Le seguenti sezioni (7 - 9) e le procedure sono state pubblicate prima del 14 . Consultare questi riferimenti per ulteriori informazioni visive. <ol><li> Preparare una soluzione agar (40 mg / mL agarosio, ossia 4% in ddH2O). Versare la soluzione agarica in un piatto di Petri e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente. Conservare la piastra agar coperta in frigorifero per un uso futuro durante la tranciatura del tessuto cerebrale. </li><li> Fluido spinale cerebrale artificiale (ACSF) con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,2-7,4 e osmolarità: 295-310 mOsm / L).</li><li> Pulire l&#39;area di lavoro e vibratome con il 70% EtOH e sciacquare la lama con acqua distillata. </li><li> Mettere un rilievo di assorbimento del liquido pulito sull&#39;area di lavoro con strumenti appropriati di dissezione. </li><li> Prendete il piatto agar fuori dal frigorifero, tagliate un piccolo cubo di agar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Incollare il blocco agar allo stadio di una camera di taglio vibratome utilizzando superglue commercialmente disponibili. </li></ol> 8. Isolamento del Brainstem auditory del pollo <ol><li> Apri l&#39;uovo al sito della finestra con tappa. Puntare il sacchetto di membrana con un bisturi e togliere la testa dell&#39;embrione di pollo. </li><li> Decapitate il pollo con forbici affilate. </li><li> Posizionare la punta della lama del rasoio leggermente posteriore agli occhi. Incise attraverso il cranio alla linea mediana rostral-caudale. Applicare una leggera pressione a seconda dell&#39;età dell&#39;embrione. Gli embrioni più anziani richiedono maggiore pressione. </li><li> Spingere delicatamente la pelle e le piume per esporre il cranio e verificare la taglia della linea mediana. </li><li> Applicare sPressione del tronco, tagliare la porzione rostrale del cranio con una lama di rasoio. Immediatamente posizionare la lama posteriore agli occhi e tagliare tutto il cranio e il tessuto cerebrale. </li><li> Fare incisioni midline-to-lateral con forbici nella zona caudale del cranio, leggermente anteriori ai muscoli del collo su entrambi i lati della testa. Esponete il cervello e il cervelletto tirando via il cranio e il tessuto in eccesso. </li><li> Tagliare il tessuto attaccato al tronco cerebrale con forbici e rimuovere il tronco cerebrale, che si libera liberamente dal cranio. </li></ol> 9. Preparazione delle fette del Brainstem per l&#39;elettrofisiologia o l&#39;imaging in vivo <ol><li> Infilare il cervello attraverso la tecnica ottica. </li><li> Rimuovere il cervelletto tagliando peduncle con forbici, esponendo il pavimento del quarto ventricolo. </li><li> Usando le pinzette, rimuovete i tessuti membranosi e i vasi sanguigni dalla superficie cerebrale. </li><li> Per bloccare il sistema cerebrale, fare un taglio orizzontale all&#39;estremità più rostrale del pavimento dei quattroVentricolo, appena caudale alla corteccia. Fare tagli laterali perpendicolari attraverso l&#39;ottica tecta per isolare il sistema cerebrale. </li><li> Posizionare una piccola quantità di colla super sullo stadio vibrativo direttamente di fronte al blocco agar. </li><li> Sollevare il tronco cerebrale al midollo spinale usando le pinzette e posizionarlo sulla colla super con il lato rostralo verso il basso e il lato dorsale verso la lama vibratome. Rimuovere la colla in eccesso con un tessuto di laboratorio o carta filtrante. </li><li> Versare l&#39;ACSF ossigenato nella fase vibratome. Impostare la lama del vibratore ad un angolo di 20-22 °. Avviare il vibratore ad oscillazione massima-ampiezza. Spostare il palco verso la lama in modo che la parte superiore del tessuto sia parallela alla lama. </li><li> Spostare rapidamente la lama verso il tessuto cerebrale. Rallenta lentamente la lama prima del contatto della lama con il tessuto. </li><li> Togliere il tessuto con la velocità di avanzamento più lenta possibile. Una volta che la lama attraversa l&#39;intera sezione del tessuto coronale, rimuovere delicatamente la fetta usando una pipetta di trasferimento/ Li&gt; <li> Abbassare lo stadio 200-300 μm e tagliare di nuovo. Ripetere fino a quando non saranno visibili punti di riferimento anatomici dei nuclei uditivi, ad esempio la distinta regione nervosa dorsale / ventrale della NL e la posizione media di NM rispetto alla NL. </li><li> Conservare con attenzione le fette in ACFS. Ciò può essere fatto a temperatura ambiente (22 ° C) o vicino a condizioni fisiologiche (~ 41 ° C) usando un bagno d&#39;acqua caldo. Notare l&#39;ordine di affettatura. La prima fetta corrisponde alla regione più caudale del tessuto e l&#39;ultima fetta corrisponde alla regione più rostrale. Questo rappresenta approssimativamente l&#39;organizzazione tonotopica del sistema cerebrale uditivo, da regioni di codifica a bassa frequenza ad alta frequenza. </li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39; elettroporazione in ovo è un metodo per esprimere o abbattere i geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Nell&#39;embrione di pollo, è un metodo innovativo per esprimere geni codificati da plasmide in diverse regioni del sistema cerebrale uditivo 8 . Per garantire un&#39;espressione ottimale, sono necessari diversi passaggi critici. In primo luogo, solo iniettare gli embrioni ...

La codifica neurale veloce del suono è essenziale per le normali funzioni uditive. Queste includono abilità di localizzazione sonora 1 , discorso in discriminazione di rumore 2 e comprensione di altri segnali di comunicazione rilevati dal comportamento 3 . I neuroni analoghi situati nel sistema cerebrale uditivo sia degli aviani che dei mammiferi sono altamente specializzati per la codifica neuronale veloce 4 . Questi includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM), il nucleo laminaris (NL) ei loro analoghi dei mammiferi, il nucleo cocleare anteroventrale (AVCN) e l&#39;olio superiore mediale (MSO) rispettivamente 5 . Tuttavia, i meccanismi di sviluppo che regolano la codifica neuronale veloce sono poco compresi nel sistema cerebrale uditivo. Pertanto è vantaggioso studiare geni specifici responsabili della codifica veloce veloce al fine di comprendere meglio la loro espressione, regolazione e funzionalità in auLo sviluppo dei dati. L&#39;embrione di pollo in fase di sviluppo è uno strumento di ricerca efficace e consolidato per studiare le questioni biologiche fondamentali dello sviluppo del sistema uditivo 6 , 7 . Recenti progressi molecolari hanno affrontato queste questioni biologiche nell&#39;embrione di pollo in fase di sviluppo esprimendo o abbattendo geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Indagare sul ruolo di regolamentazione di geni specifici è un progresso significativo nella comprensione delle patologie associate a deficit auditari. Qui presentiamo l&#39;elettroporazione in ovo di geni codificati da plasmide nel tronco uditivo del pollo dove si verifica una veloce codifica neurale del suono 10 . Targetando regioni neuroni uditive uditive associate ai rombomeri 5 e 6 11 , 12 (R5 /R6), mostriamo il controllo spaziale della transfezione plasmida in NM e NL. Inoltre, mostriamo la regolazione temporale dell&#39;espressione adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox) 8 .

<table><tbody><tr><td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, single or dual channel</td></tr><tr><td>Current/voltage stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil syringe needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td></tr><tr><td>Stimulating microelectrode</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Air tank/regulator</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Egg refrigerator</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &amp;deg;C (56-61&amp;deg; F)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &amp;deg; C (100 &amp;deg; F), ~50% humidity</td></tr><tr><td>Dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td></tr><tr><td>Cold-light source</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td></tr><tr><td>Syringes</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD Precision Glide&amp;nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Egg holder</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Clay base works as well</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

L&#39;elettroporazione è un metodo che introduce geni di interesse in organismi biologicamente rilevanti come l&#39;embrione di pollo. È da tempo stabilito che l&#39;embrione di pollo è un modello di ricerca efficace per studiare le funzioni biologiche di base dello sviluppo del sistema uditivo. Più di recente, l&#39;embrione di pollo è diventato particolarmente prezioso nello studio dell&#39;espressione genica, della regolazione e della funzione associata all&#39;udito. L&#39; elettroporazione in ovo può essere impiegata per individuare le regioni del sistema cerebrale uditivo responsabili di funzioni uditive altamente specializzate. Queste regioni includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM) e nucleo laminaris (NL). Neuroni NM e NL derivano da precursori distinti di rombomeri 5 e 6 (R5 / R6). Qui, presentiamo l&#39;elettroporazione in ovo in geni codificati da plasmidi per studiare proprietà correlate al gene in queste regioni. Mostriamo un metodo per il controllo spaziale e temporale dell&#39;espressione genica che favorisce il guadagno o la perdita di fenotipo funzionalees. Targetando regioni di progenitor neurali uditive associate a R5 / R6, mostriamo la transfezione plasmida in NM e NL. La regolazione temporale dell&#39;espressione genica può essere ottenuta adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox). La tecnica di elettroporazione in ovo , insieme con i test funzionali biochimici, farmacologici e in vivo , fornisce un approccio innovativo per lo studio dello sviluppo del neurone uditivo e dei fenomeni patofisiologici associati.

Qui mostriamo che l&#39;elettroporazione in ovo consente l&#39;espressione genica in un sistema biologico normalmente sviluppato. I geni codificati con plasmide vengono iniettati focalamente nel tubo neurale sovrastante R5 / R6. Un esempio schematico delle posizioni dell&#39;elettrodo e delle pipette relative a importanti marcatori anatomici è mostrato nella figura 1A . La posizione corretta dell&#39;iniezione del plasmide è confermata 24 h dopo l&#39;elettrop...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell&#39;indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell&#39;hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K Views.  Northwestern University.  I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo. 

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Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at discreet periods of development 1-4 as well as mechanisms for temporal coding in the central nervous system 5-7.
Here we present a method to prepare chicken auditory brainstem slices that can be used for acute experimental procedures or to culture organotypic slices for long-term experimental manipulations.
The chicken auditory brainstem is composed of nucleus angularis, magnocellularis, laminaris and superior olive. These nuclei are responsible for binaural sound processing and single coronal slice preparations preserve the entire circuitry. Ultimately, organotypic slice cultures can provide the opportunity to manipulate several developmental parameters such as synaptic activity, expression of pre and postsynaptic components, expression of aspects controlling excitability and differential gene expression
This approach can be used to broaden general knowledge about neural circuit development, refinement and maturation.

The chicken auditory brainstem is comprised of nuclei responsible for binaural sound processing. A single coronal slice preparation maintains the entire circuitry while the cultured approach provides a unique preparation to study the development of neuronal structure and auditory function at the molecular, cellular and network levels.

La preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Ricerca

Neuroscienze

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Biologia dello sviluppo

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biologia

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology differentially oriented along a tonotopic (i.e., frequency) axis. The tonotopic axis permits the segregated encoding of high-frequency sounds in the rostral-medial plane and low-frequency encoding in caudo-lateral regions. Traditionally, coronal brainstem slices of embryonic tissue permit the study of relative individual iso-frequency lamina. Although sufficient to investigate anatomical and physiological questions pertaining to individual iso-frequency regions, the study of tonotopic variation and its development across larger auditory brainstem areas is somewhat limited. This protocol reports brainstem slicing techniques from chicken embryos that encompass larger gradients of frequency regions in the lower auditory brainstem. The utilization of different slicing methods for chicken auditory brainstem tissue permits electrophysiological and anatomical experiments within one brainstem slice, where larger gradients of tonotopic properties and developmental trajectories are better preserved than coronal sections. Multiple slicing techniques allow for improved investigation of the diverse anatomical, biophysical, and tonotopic properties of auditory brainstem microcircuits.

Here we present a protocol for obtaining non-coronal auditory brainstem slices of the chicken embryo for the investigation of tonotopic properties and developmental trajectories within one brainstem slice. These slices include sagittal, horizontal, and horizontal/transverse sections encompassing larger tonotopic regions within an individual slice plane that the traditional coronal sections.

Affettare il tronco cerebrale uditivo embrionale del pollo per valutare gradienti tonotopici e microcircuiti

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

Valutazione della risposta uditiva del tronco cerebrale nei cuccioli di pollo

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo