L'età, l'infezione e i farmaci ototossici possono causare la degenerazione delle cellule ciliate dell'orecchio interno, che in noi porta alla perdita dell'udito. Nei vertebrati non mammiferi, come il pulcino, le cellule ciliate possono essere rigenerate. Le tecniche qui descritte sfruttano l'efficacia in termini di costi del lavoro sugli embrioni di pulcino, la facilità di ottenere embrioni e il buon sviluppo esometrico degli espianti di tessuto.
Comprendere lo sviluppo e la rigenerazione dei peli dell'orecchio interno aviario può fornire importanti informazioni sulla perdita dell'udito e sulle potenziali terapie, e la coltura degli espianti può essere importante per valutare gli effetti ototossici di vari farmaci. Prima di iniziare l'esperimento, procurati uova appena deposte e puliscile con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione. Incubare le uova per 3,5-4 giorni, a 37-38 gradi Celsius con il 45% di umidità.
Dopo l'incubazione, riposizionare l'embrione sulla parte superiore del tuorlo, posizionando un uovo su un lato per cinque minuti. Quindi, utilizzare una pinza per praticare un piccolo foro nella parte superiore e un'estremità smussata dell'uovo per far passare un ago di calibro 21. Utilizzando una siringa da cinque millilitri e un ago da 21 gauge, rimuovere due millilitri di albumina da un foro all'estremità smussata dell'uovo.
Coprire il foro all'estremità smussata con nastro trasparente. Per fare in modo che la finestra dell'uovo applichi il nastro trasparente sulla parte superiore del guscio d'uovo. Tenere gli aghi dalla microiniezione da capillari di vetro standard utilizzando un estrattore di pipette verticale.
Dopo aver tirato, rompere la punta capillare utilizzando una pinza fine per ottenere un diametro della punta di circa 50 micrometri con un'estremità affusolata. Per l'esperimento di knockout genico, mescolare i tre costrutti, vale a dire il plasmide guida, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP in un rapporto uno-a-uno-a-uno con un microgrammo di proteina SP Cas9, 30% di saccarosio e 0,1% di colorante verde veloce e un volume finale di 10 microlitri. Durante l'elettropostazione di più plasmidi, assicurarsi che la concentrazione finale di DNA sia di almeno quattro microgrammi per microlitro.
Con l'aiuto delle forbici a forbice a molla tagliare intorno a una finestra lunga due centimetri e larga 1,5 centimetri ed esporre l'embrione. Quindi utilizzare una pinza per aprire le membrane coriali sovrastanti l'embrione, consentendo l'accesso all'embrione. Iniettare circa 200 nanolitri di volume di miscela di soluzione di DNA per riempire la vescicola otica.
Per determinare l'efficienza dell'RNA guida eseguire un test di endonucleasi T7. Aggiungere lo 0,719% di gocce saline all'embrione per abbassare la resistenza elettrica e prevenire il surriscaldamento. Quindi, posizionare l'elettrodo positivo attraverso il foro praticato sul lato smussato dell'uovo e manovrare l'elettrodo in modo che sia sotto il tuorlo.
Posizionare l'elettrodo negativo sopra l'otocisti riempita. Per trasfettare il plasmide nella vescicola otica con elettroporazione, utilizzare un generatore di impulsi quadrati e applicare cinque impulsi di 25 volt per 100 millisecondi ciascuno, a 50 millisecondi di distanza. Determinare empiricamente le condizioni sulla base di una singola configurazione di elettroporazione.
Dopo l'elettroporazione, idratare l'embrione aggiungendo alcune gocce di soluzione salina allo 0,719%. Richiudere l'uovo con nastro trasparente e tornare all'incubatore umidificato a 37-38 gradi Celsius per un'ulteriore incubazione. Disinfettare il tavolo chirurgico, lo stadio del microscopio e l'area circostante utilizzando il 70% di etanolo e calore, oppure sterilizzare con alcool l'attrezzatura di micro dissezione, comprese le forbici per arco a molla, il micro curet e due paia di pinze sottili.
Preparare le piastre di dissezione tra cui una capsula di Petri di vetro con una base di silicone nero, una capsula di Petri di plastica da 90 millimetri e una capsula di Petri da 60 millimetri. Tenere il PBS refrigerato o la soluzione salina bilanciata di Hanks, nota anche come HBSS, pronta per le dissezioni. Rompere delicatamente l'uovo nella capsula di Petri da 90 millimetri.
Quindi identificare l'orecchio esterno del pulcino e trasferire la testa su una capsula di Petri da 60 millimetri piena di PBS ghiacciato. Quindi, orientare l'embrione con la parte superiore del becco rivolta verso l'interno e tenere il becco usando una delle pinze numero cinque. Raccogli gli occhi usando la seconda pinza numero cinque.
Quindi, dal rostrale al caudale, taglia lungo il cranio lungo la sua linea mediana e scava il cervello. Aggiungi più PBS ghiacciato, o HBSS, e individua i due otoliti della lagena come strutture lucide alla fine del dotto cocleare e vicino alla linea mediana. Per isolare due orecchie interne, tagliare tra le due lagene e ben sopra e sotto la regione.
Quindi sotto illuminazione obliqua visualizzare il contorno dell'orecchio interno e rimuovere il tessuto estraneo e il vestibolo. Trasferire la coclea isolata su una piastra di base in silicone nero con PBS ghiacciato. Rimuovere la capsula cocleare cartilaginea usando una pinza numero cinque per ottenere il dotto cocleare.
Quindi individuare lo strato ondulato o il tegmentum del dotto cocleare e rimuoverlo usando una pinza numero 55 per esporre la papilla basilare o BP. Quindi, rimuovere la membrana tettorica per esporre le cellule ciliate e le cellule di supporto usando il forcipe numero 55. Per la coltura a membrana della papilla basilare, prendere una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti e disporre un inserto di membrana di coltura per pozzetto. Aspirare alcuni supporti in una pipetta da 200 microlitri, quindi aspirare l'espianto di papilla basilare sezionato con un tampone X HBSS.
Trasferire l'espianto su una membrana e orientarlo in modo che la papilla basilare sia rivolta verso l'alto e che i capelli e le cellule di supporto siano visibili dall'alto. Una volta posizionato l'espianto, aspirare lentamente il tampone HBSS dalla superficie della membrana di coltura. In questo processo l'espianto si attaccherà alla membrana di coltura.
Riempire il pozzetto della piastra a sei pozzetti aggiungendo 1,2 millilitri di terreno di coltura modificato di dulbecco, o terreno di coltura DMEM, tra l'inserto della membrana e la parete del pozzo. Per preparare la coltura di collagene del dotto cocleare aggiungere tre gocce di miscela di collagene appena preparata in ciascun pozzetto di una piastra a quattro pozzetti e trasferire il dotto cocleare sezionato a ciascuna goccia di collagene. Incubare la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per curare la matrice di collagene.
Per un trattamento a piccole molecole delle colture, sostituire i terreni di coltura con 700 microlitri di terreno integrato con il modulatore farmacologico, come la penicillina, e incubare le piastre come dimostrato in precedenza. Sostituire il 50% dei terreni di coltura ogni giorno. Dopo un adeguato tempo di incubazione, rimuovere i terreni di coltura e utilizzare gli espianti per i saggi a valle.
Nella configurazione dell'elettroporazione, il corretto posizionamento dell'elettrodo ha comportato una maggiore espressione di GFP nell'orecchio interno in entrambi gli organi vestibolari e una papilla basilare uditiva che conferma la trasfezione. CRISPR Cas9 ha mediato il knockout del gene Atoh1 nell'orecchio interno, con conseguente perdita di cellule ciliate. Il knockout del gene Atoh1 tramite ovo-elettroporazione seguita da incubazione fino a E10 ha mostrato uno sviluppo ridotto delle cellule ciliate rispetto al controllo plasmidico vuoto.
Sebbene l'elettroporazione sia a mosaico, le cellule elettroporate di controllo sono state in grado di formare cellule ciliate. Nei campioni elettroporati di gRNA Atoh1, le cellule positive alla proteina fluorescente verde non hanno mai mostrato i marcatori dello sviluppo delle cellule ciliate. La coltura d'organo della papilla basilare in una matrice 3D, come collagene e colorazione con anticorpi contro l'antigene delle cellule ciliate, ha fornito l'eccellente conservazione della morfologia dei tessuti per un massimo di cinque giorni.
L'organizzazione delle cellule ciliate e delle cellule di supporto è stata mantenuta in queste condizioni di coltura. Le colture di organi su una membrana possono essere mantenute fino a cinque giorni mantenendo l'integrità del fascio di capelli. Questo può essere visto nell'immagine rappresentativa dalla localizzazione della proteina tip link, protocaderina 15.
Per studiare lo sviluppo del fascio di capelli, l'imaging ad alta risoluzione, come la microscopia a super risoluzione o la microscopia elettronica a scansione, può fornire ulteriori informazioni. Le condizioni sterili devono essere mantenute durante tutta la procedura. Durante l'elettropore, assicurarsi che gli embrioni non si secchino.
Quando si titolano gli inibitori farmacologici, si può ridurre la concentrazione per superare qualsiasi letalità. Sia gli embrioni che gli espianti possono essere prelevati per esperimenti di imaging. Eseguendo la microscopizzazione video in tempo reale o la microscopia elettronica confocale a luce statica, come mostrato nel protocollo.
Data la facilità e l'accessibilità dell'utilizzo di espianti di orecchio interno di pulcino, possiamo utilizzare il mezzo attraverso lo screening di prova per identificare nuove molecole essenziali per la rigenerazione delle cellule ciliate.
