Le colture organotipiche della corteccia adulta umana sono finora l'unico sistema per testare le terapie con cellule staminali per la corteccia danneggiata che consente di studiare l'interazione tra cellule umane innestate e cellule ospiti umane. Una terapia testata in modelli animali di solito fallisce quando tradotta in contesti clinici a causa delle differenze tra cellule di roditori e cellule umane. Qui, possiamo studiare le cellule innestate, la sopravvivenza, la differenziazione e la funzionalità in un ambiente da uomo a uomo.
Questa metodologia ci aiuterà a capire come funziona il circuito neurale nel cervello umano e stimolerà anche la traduzione di queste conoscenze in contesti clinici per migliorare il recupero funzionale dopo il danno cerebrale. A dimostrare la procedura saranno Raquel Martinez-Curiel, dottoranda, e Costanza Aretio-Medina, studentessa di master, entrambe del mio laboratorio. Per iniziare, posizionare gli inserti di coltura in una piastra a sei pozzetti usando una pinza nel laboratorio di coltura cellulare sotto un cappuccio ventilato.
Aggiungere cinque millilitri del mezzo corticale adulto umano sul fondo dell'inserto fino a quando non entra in contatto con la membrana. Evitare la formazione di bolle e aggiungere due millilitri del mezzo sulla parte superiore dell'inserto. Prima di trasferire le fette di tessuto negli inserti, equilibrarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per almeno due ore.
Raccogliere il tessuto dal paziente in sala operatoria in un contenitore di soluzione di taglio congelata, bollata e schiacciata. Trasferire immediatamente il contenitore chiuso sul ghiaccio nell'area di taglio del laboratorio. Ispezionare il tessuto e, considerando l'orientamento dello strato corticale, individuare la superficie migliore per incollarlo allo stadio di taglio del vibratomo.
Se necessario, tagliare la superficie irregolare con il bisturi per posizionare il tessuto sul palco per un orientamento ottimale delle fette. Quindi, incollare il tessuto sul palco con adesivo velinato. Metterlo nella camera di affettatura e riempirlo immediatamente con una soluzione di taglio fredda e a bolle.
Continuare la gorgogliatura durante tutta la procedura di taglio. Ora taglia fette coronali o sagittali a seconda dell'orientamento tessuto-lama come descritto nel manoscritto. Posizionare le fette nella camera di raccolta con soluzione di taglio gorgogliante a temperatura ambiente.
Una volta che tutto il tessuto è stato tagliato, trasferire le fette in una capsula di Petri sterile con soluzione di risciacquo a temperatura ambiente per rimuovere il saccarosio in eccesso dalle fette e trasportarle al laboratorio di coltura cellulare. Quindi, posizionare le fette di tessuto singolarmente sopra gli inserti bagnati e sommersi. Dopo 24 ore, cambiare il terreno per rimuovere eventuali residui di saccarosio o altre sostanze residue dalla procedura di taglio.
Dopo due settimane, utilizzare il mezzo corticale adulto umano senza gentamicina. Rimuovere il supporto dal pallone di coltura cellulare. Il settimo giorno di differenziazione, staccare le cellule GFP-lt-NES innescate corticalmente aggiungendo 500 microlitri di tripsina e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere un volume uguale dell'inibitore della tripsina seguito da cinque millilitri di mezzo DDM. Risospendere le cellule, trasferire delicatamente la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 300 G.Nel frattempo, trasferire la piastra contenente il tessuto umano dall'incubatore al cappuccio e rimuovere due millilitri di supporto dalla parte superiore dell'inserto. Al termine della centrifugazione, rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in una matrice di membrana basale fredda, pura, e trasferire la pensione in un tubo più piccolo.
Raccogliere la sospensione cellulare in un capillare di vetro freddo collegato a una tettarella di gomma per l'aspirazione. Iniettare la sospensione cellulare come piccole gocce pugnalando la fetta di tessuto semi-secco in vari siti. Lasciare solidificare il gel a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, trasferire la piastra dall'incubatore al cappuccio e aggiungere con attenzione due millilitri di mezzo corticale adulto umano nella parte superiore dell'inserto per immergere completamente il tessuto. Il tessuto corticale adulto umano acuto ha mostrato la presenza di neuroni, oligodendrociti e astrociti che mostrano una conservazione ottimale del tessuto. Il tessuto ha mostrato l'espressione dei marcatori neuronali NeuN e Map2 dopo due settimane di coltura cellulare.
La registrazione dell'intero patch clamp cellulare ha mostrato che i neuroni avevano un potenziale di membrana a riposo e una resistenza all'input di membrana, paragonabile ai neuroni di preparazioni acute. Le cellule erano leggermente meno attive rispetto al tessuto fresco, sebbene la maggior parte delle cellule fosse in grado di attivare almeno uno se non più potenziali d'azione. Il tessuto corticale acuto ha mostrato l'espressione dei marcatori microgliali Iba1 e Tmem119.
Dopo due settimane in coltura, la microglia è diventata meno ramificata e ha acquisito una morfologia più attivata rispetto al tessuto acuto. Quattro settimane dopo il trapianto ex vivo, le cellule GFP-lt-NES innestate hanno mostrato neuriti estesi con arborizzazioni estese e complesse in tutta la coltura organotipica. Quasi nessuna cellula innestata è sopravvissuta in tessuto mal conservato.
Detriti ed etichettatura non specifica degli anticorpi sulle cellule morte sono stati ampiamente osservati in tutta la fetta umana. In caso di trapianto riuscito, le cellule sono diventate funzionalmente attive e i neuroni maturi hanno mostrato potenziali d'azione ripetitivi e spesso spontanei. Il sodio verso l'interno veloce, le correnti di potassio lente verso l'esterno e un certo livello di attività sinaptica indicano l'integrazione funzionale dell'innesto con il tessuto ospite quattro settimane dopo l'innesto.
Più velocemente il tessuto umano viene elaborato una volta uscito dalla sala operatoria, maggiore è la vitalità del sistema e il successo della procedura sperimentale.
