La micro-TC è un approccio molto comune per quantificare la morfologia 3D e la qualità dell'osso. Sebbene i protocolli di analisi siano abbastanza consolidati per la caratterizzazione dell'osso corticale e trabecolare intatto, c'è meno consenso sul protocollo per l'analisi della guarigione delle fratture. Questa tecnica prevede l'imaging non invasivo e l'analisi 3D accurata e calibrata utilizzando un buon equilibrio tra tecniche manuali e automatizzate.
Utilizza inoltre un ambiente software sofisticato e flessibile. A dimostrare la procedura sarà Hwabok Wee, un ricercatore associato del mio laboratorio. Per iniziare, prendi un dispositivo di scansione stampato in 3D sviluppato su misura o simile che include un fantoccio di idrossiapatite in miniatura per la calibrazione della densità minerale ossea.
Posizionare fino a sei campioni di ossa lunghe nell'apparecchiatura per la scansione simultanea di più campioni. Posizionare l'apparecchio preparato in una siringa o in un tubo conico simile al diametro del campo visivo di scansione. Riempire la siringa con un conservante, come la soluzione fisiologica, per evitare che i campioni si secchino durante il processo di scansione.
Dopo aver confermato la calibrazione della macchina micro-CT, allineare la linea centrale del dispositivo del campione con la linea centrale approssimativa della micro-CT per assicurarsi che i campioni si trovino all'interno del campo visivo e che i loro assi lunghi abbiano un orientamento approssimativamente coincidente con la direzione assiale delle immagini risultanti. Successivamente, impostare i parametri di scansione del sistema micro-CT impostando l'energia o l'intensità su 55 kilovoltage di picco, la corrente su 145 microampere, la dimensione del voxel isotropo su 10,5 micrometri e il tempo di integrazione su 300 millisecondi. Quindi ispezionare visivamente le immagini scout in diverse viste per coprire l'intero volume di tutti i campioni di callo.
Avviare l'acquisizione della scansione e, una volta completata, convertire le immagini in uno stack DICOM per importarle nel software di analisi. Per iniziare con il ritaglio dell'immagine, scegli un campione alla volta e ritaglia ogni pila di immagini, assicurandoti che l'intero campione sia incluso nel volume ritagliato. Salvare l'immagine ritagliata facendo clic sulla scheda File nella parte superiore sinistra dello schermo, selezionando Salva progetto con nome e quindi selezionando Riduci dimensioni progetto.
Per ridurre il rumore dell'immagine, fare clic sulla scheda File e scegliere l'immagine da elaborare utilizzando Open Data, che apre l'immagine nella finestra Vista progetto nell'angolo in alto a sinistra dello schermo. Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Elaborazione immagini, quindi Sandbox filtro, quindi fare clic su Crea. Nella finestra Proprietà nell'angolo in basso a sinistra dello schermo, scegli Dati come tipo di anteprima.
Seleziona il tipo di filtro dal menu a discesa accanto a Filtro e scegli 3D per l'interpretazione. Mantenendo Separabile come tipo di kernel nel menu a discesa, inserire i valori della deviazione standard e del fattore di dimensione del kernel nella casella vuota disponibile. Quindi seleziona Uguale all'input dal menu a discesa accanto all'output.
Infine, fai clic su Applica. Per i campioni disallineati, l'utente può eseguire il riallineamento dell'immagine creando un'immagine renderizzata in 3D del campione selezionando l'immagine filtrata e ritagliata dalla finestra Vista progetto. Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Visualizzazione e quindi Rendering volume dal menu a discesa.
Quindi fare clic su Crea per controllare visivamente l'immagine renderizzata in 3D nei piani sagittale e frontale. Quindi ruotare manualmente il volume di rendering per ottenere un buon allineamento nell'asse longitudinale. Per applicare la trasformazione alle immagini ruotate, nella finestra Proprietà, fare clic sull'Editor trasformazioni.
Quindi vai su Transform Editor Manipulator e seleziona Transformer dal menu a discesa. Se necessario, ruotare, riallineare, quindi fare nuovamente clic sull'editor di trasformazione per bloccare l'immagine. Successivamente, per creare nuove sezioni di immagine del piano trasversale, ricampionate l'immagine filtrata selezionandola dalla finestra Vista progetto.
Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Trasformazione geometria, quindi Ricampiona immagine trasformata dal menu a discesa, quindi fare clic su Crea. Nella finestra Proprietà, vai a Dati e, dal menu a discesa, seleziona Standard per l'interpolazione, scegli Esteso per la modalità e Dimensione voxel per conservare. Immettere zero nella casella vuota disponibile per il valore di riempimento e, infine, fare clic su Applica.
Per definire il volume di interesse, passare attraverso le sezioni trasversali dell'immagine, identificare il piano centrale del callo di frattura e definirlo in base al cristallino prossimale e distale del callo. Se le estremità del callo sono difficili da specificare, definire il volume in base a una distanza standardizzata dal piano centrale del callo. Per segmentare il contorno esterno del callo dopo il riassemblaggio delle immagini trasformate, fare clic sulla scheda Segmentazione nella seconda riga della scheda nella parte superiore dello schermo.
Nella finestra dell'editor di segmentazione, seleziona l'immagine trasformata dal menu a discesa accanto all'immagine. Nella finestra MATERIALI (MATERIALS), fate doppio clic su Aggiungi (Add). In questo modo, appariranno due schede denominate Materiale3 e Materiale4.
Fare clic con il pulsante destro del mouse per rinominare Materiale3 in callo e Materiale4 in osso corticale. Successivamente, nella finestra SELEZIONE, fare clic sull'icona lazo. Dalle opzioni visualizzate, selezionate Mano libera per la modalità 2D, Interno per la modalità 3D e Traccia automaticamente e Traccia spigoli per le opzioni.
Quindi usa il lazo per segnare il confine esterno del callo. Ripetere i passaggi di contornatura con le sezioni campionate attraverso il volume di interesse e le sezioni possono essere distanziate, ad esempio, di 20 fette. Per creare un'etichetta completa per i calli, nella finestra MATERIALI, scegliete il file dei calli, fate clic sulla scheda Selezione nella parte superiore dello schermo e selezionate Interpolazione dal menu a discesa.
Quindi, nella finestra Selezione, fare clic sul segno più. Quindi, segmenta l'osso corticale, compresa la cavità midollare. Quindi interpolare la superficie sagomata della corteccia periostale per creare un'etichetta ossea corticale come eseguito in precedenza per il callo.
Per calcolare il volume sagomato e il valore medio del grigio del callo, fare clic sulla scheda Segmentazione nella riga superiore dello schermo e selezionare Statistiche materiale dal menu a discesa per generare una tabella dei valori calcolati. Si noti che i valori dell'osso corticale e del callo sono forniti separatamente dopo aver sottratto l'osso corticale. Esportare la tabella generata e salvare i dati facendo clic su Esporta nell'area di lavoro.
Per convertire le unità in scala di grigi in densità minerale ossea, ritagliate l'immagine 3D del fantoccio HA da 4,5 millimetri dall'intera immagine e fate clic su Segmentazione. Per disegnare cerchi in corrispondenza della prima e dell'ultima sezione, nella finestra MATERIALI fare clic su Aggiungi quattro volte. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse per rinominare Material3, 4, 5 e 6 rispettivamente in Phantom1, 2, 3 e 4.
Selezionare quindi Phantom1. Fate clic sull'icona del pennello nella finestra Selezione (Selection) e utilizzate il cursore per regolare le dimensioni del pennello in modo che le dimensioni del cerchio siano inferiori a quelle del fantoccio. Per creare un volume per ogni cilindro HA, applicate l'interpolazione selezionando Phantom1 nella finestra MATERIALI (MATERIALS), facendo clic sulla scheda Selezione (Selection) nella riga superiore dello schermo e selezionando Interpola (Interpolate) dal menu a discesa.
Quindi, nella finestra SELEZIONE, fare clic sul segno più. Ripetere questo processo con le restanti bombole HA. Utilizzare le etichette 3D generate per calcolare i valori medi di grigio dei quattro cilindri HA analizzati.
Tracciare i valori medi di grigio e i corrispondenti valori di densità minerale ossea, o BMD, forniti dal produttore del fantoccio. Generare un'equazione di correlazione tra BMD e i valori di grigio utilizzando la regressione lineare. Per segmentare il callo mineralizzato, fate clic su Aggiungi (Add) nella finestra MATERIALI (MATERIALS).
Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse per rinominare il nuovo materiale in callo mineralizzato. Quindi, selezionate Callus (Callus) nella finestra MATERIALI (MATERIALS), quindi fate clic su Seleziona (Select). Quindi fare clic su Soglia nella finestra SELEZIONE.
Selezionare il valore più basso e applicare la soglia calcolata dal mascheramento HA nel mascheramento di soglia. Quindi fare clic su Seleziona solo materiale corrente nella finestra SELEZIONE, quindi fare clic su Seleziona voxel mascherati. Quindi selezionare il callo mineralizzato nella finestra MATERIALI e fare clic sul segno più nella finestra SELEZIONE.
Infine, fare clic su 3D del callo mineralizzato nella finestra MATERIALI. Le immagini micro-CT analizzate in tre punti temporali hanno mostrato la sostanziale formazione di callo mineralizzato il giorno 14. Aumenti incrementali del volume della frazione ossea e della densità minerale ossea sono stati osservati man mano che la guarigione procedeva dal giorno 14 ai giorni 21 e 28, coerentemente con il collasso osseo del gap di frattura.
Come previsto, il callo ha subito un riassorbimento o un rimodellamento tra i giorni 21 e 28, come evidenziato da un calo del volume totale del callo. Il ponte corticale del callo era più evidente al giorno 28 che in qualsiasi altro punto temporale precedente. Per le fratture complesse, si consiglia di esaminare attentamente la segmentazione semiautomatica risultante scorrendo tutte le sezioni dell'immagine, a volte su piani diversi, e regolando i contorni se necessario.
Una volta che il callo di frattura è stato accuratamente segmentato, i parametri di esito, oltre a quelli riportati in questo protocollo, possono essere calcolati con script aggiuntivi. Questi includono, ad esempio, i momenti di inerzia e la densità di connettività.
