A micro-TC é uma abordagem muito comum para quantificar a morfologia 3D e a qualidade do osso. Embora os protocolos de análise sejam bastante estabelecidos para caracterizar a cortical e o trabecular intactos, há um menor consenso sobre o protocolo de análise da consolidação da fratura. Esta técnica envolve imagens não invasivas e análise 3D precisa e calibrada, usando um bom equilíbrio de técnicas manuais e automatizadas.
Também utiliza um ambiente de software sofisticado e flexível. Quem demonstrará o procedimento será Hwabok Wee, pesquisador associado do meu laboratório. Para começar, pegue um acessório de digitalização impresso em 3D desenvolvido sob medida ou similar que inclua um simulador de hidroxiapatita em miniatura para calibração da densidade mineral óssea.
Coloque até seis amostras de ossos longos no acessório para a varredura simultânea de várias amostras. Coloque o acessório preparado em uma seringa ou em um tubo cônico semelhante ao diâmetro do campo de visão de varredura. Encha a seringa com um conservante, como soro fisiológico, para evitar que as amostras sequem durante o processo de digitalização.
Após a confirmação da calibração do micro-CT, alinhe a linha central do dispositivo de amostragem com a linha central aproximada do micro-CT para garantir que as amostras estejam dentro do campo de visão e seus longos eixos tenham orientação aproximadamente coincidente com a direção axial das imagens resultantes. Em seguida, defina os parâmetros de varredura do sistema de micro-TC definindo a energia ou intensidade para 55 quilogramas de pico, corrente para 145 microampères, tamanho isotrópico do voxel para 10,5 micrômetros e tempo de integração para 300 milissegundos. Em seguida, inspecione visualmente as imagens do scout em diferentes visualizações para cobrir todo o volume de todas as amostras de calos.
Inicie a aquisição da varredura e, uma vez concluída, converta as imagens em uma pilha DICOM para importá-las para o software de análise. Para começar com o corte de imagens, escolha uma amostra de cada vez e corte cada pilha de imagens, garantindo que toda a amostra seja incluída no volume cortado. Salve a imagem cortada clicando na guia Arquivo no canto superior esquerdo da tela, selecionando Salvar projeto como e, em seguida, selecionando Minimizar tamanho do projeto.
Para diminuir o ruído da imagem, clique na guia Arquivo e escolha a imagem a ser processada usando Dados Abertos, que abre a imagem na janela Modo de Exibição do Projeto no canto superior esquerdo da tela. Clique com o botão direito do mouse para selecionar Processamento de Imagem, seguido por Caixa de Proteção de Filtro e clique em Criar. Na janela Propriedades no canto inferior esquerdo da tela, escolha Dados como o tipo de visualização.
Selecione o tipo de filtro no menu suspenso ao lado de Filtrar e escolha 3D para interpretação. Mantendo Separável como o tipo de kernel no menu suspenso, preencha os valores de desvio padrão e fator de tamanho do kernel na caixa vazia disponível. Em seguida, selecione O mesmo que entrada no menu suspenso ao lado da saída.
E, por fim, clique em Aplicar. Para amostras desalinhadas, o usuário pode executar o realinhamento da imagem criando uma imagem renderizada em 3D da amostra selecionando a imagem filtrada e cortada na janela Exibição do projeto. Clique com o botão direito do mouse para selecionar Exibir e, em seguida, Renderização de Volume no menu suspenso.
Em seguida, clique em Criar para verificar visualmente a imagem renderizada em 3D nos planos sagital e frontal. Em seguida, gire manualmente o volume renderizado para obter um bom alinhamento no eixo longitudinal. Para aplicar a transformação nas imagens rotacionadas, na janela Propriedades, clique no Editor de Transformação.
Em seguida, vá para Transform Editor Manipulator e selecione Transformer no menu suspenso. Se necessário, gire, realinhe e clique no Editor de Transformação novamente para bloquear a imagem. Em seguida, para criar novas fatias de imagem de plano transversal, redefina a amostra da imagem filtrada selecionando a imagem na janela Modo de Exibição do Projeto.
Clique com o botão direito do mouse para selecionar Transformação de geometria, seguido por Reamostrar imagem transformada no menu suspenso e clique em Criar. Na janela Propriedades, vá para Dados e, no menu suspenso, selecione Padrão para interpolação, escolha Estendido para modo e Tamanho do Voxel para preservar. Digite zero na caixa em branco disponível para o valor de preenchimento e, finalmente, clique em Aplicar.
Para definir o volume de interesse, percorrer os cortes transversais das imagens, identificar o plano central do calo da fratura e defini-lo com base no cristalino proximal e distal do calo. Se as extremidades do calo forem difíceis de especificar, defina o volume com base em uma distância padronizada para longe do plano central do calo. Para segmentar o limite externo do calo após a remontagem das imagens transformadas, clique na guia Segmentação na segunda linha da guia na parte superior da tela.
Na janela do editor de segmentação, selecione a imagem transformada no menu suspenso ao lado da imagem. Na janela MATERIAIS, clique duas vezes em Adicionar. Ao fazer isso, duas guias chamadas Material3 e Material4 aparecerão.
Clique com o botão direito do mouse para renomear Material3 para calo e Material4 para osso cortical. Em seguida, na janela SELEÇÃO, clique no ícone de laço. Nas opções exibidas, selecione Mão livre para o modo 2D, Interior para o modo 3D e Rastreamento automático e Bordas de rastreamento para opções.
Em seguida, use o laço para marcar o limite externo do calo. Repita as etapas de contorno com fatias amostradas em todo o volume de interesse, e as fatias podem ser espaçadas, por exemplo, por 20 fatias. Para criar um rótulo de calo completo, na janela MATERIAIS, escolha o arquivo de calos, clique na guia Seleção na parte superior da tela e selecione Interpolar no menu suspenso.
Em seguida, na janela Seleção, clique no sinal de mais. Em seguida, segmentar a cortical óssea, incluindo a cavidade medular. Em seguida, interpole a superfície do córtex periosteal contornada para criar uma marcação óssea cortical, como realizado anteriormente para o calo.
Para calcular o volume contornado e o valor médio de cinza do calo, clique na guia Segmentação na linha superior da tela e selecione Estatísticas do material no menu suspenso para gerar uma tabela de valores calculados. Note que os valores do osso cortical e do calo são fornecidos separadamente após a subtração do osso cortical. Exporte a tabela gerada e salve os dados clicando em Exportar para Espaço de Trabalho.
Para converter as unidades de tons de cinza em densidade mineral óssea, recorte a imagem 3D do simulador HA de 4,5 milímetros de toda a imagem e clique em Segmentação. Para desenhar círculos na primeira e na última fatias, na janela MATERIAIS, clique em Adicionar quatro vezes. Em seguida, clique com o botão direito do mouse para renomear Material3, 4, 5 e 6 para Phantom1, 2, 3 e 4, respectivamente.
Em seguida, selecione Phantom1. Clique no ícone de pincel na janela Seleção e use o controle deslizante para ajustar o tamanho do pincel de forma que o tamanho do círculo seja menor que o do simulador. Para criar um volume para cada cilindro HA, aplique a interpolação selecionando Phantom1 na janela MATERIAIS, clicando na guia Seleção na linha superior da tela e selecionando Interpolar no menu suspenso.
Em seguida, na janela SELEÇÃO, clique no sinal de mais. Repita este processo com os cilindros HA restantes. Use as etiquetas 3D geradas para calcular os valores médios de cinza dos quatro cilindros de AH analisados.
Plotar os valores médios de cinza e os valores correspondentes de densidade mineral óssea, ou DMO, fornecidos pelo fabricante do simulador. Gere uma equação de correlação entre a DMO e os valores de cinza usando regressão linear. Para segmentar o calo mineralizado, clique em Adicionar na janela MATERIAIS.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse para renomear o novo material para calo mineralizado. Em seguida, selecione Calo na janela MATERIAIS, seguido de clicar em Selecionar. Em seguida, clique em Limiar na janela SELEÇÃO.
Selecione o valor mais baixo e aplique o limite calculado a partir do simulador HA no mascaramento de limiar. Em seguida, clique em Selecionar somente material atual na janela SELEÇÃO, seguido por clicar em Selecionar Voxels mascarados. Em seguida, selecione calo mineralizado na janela MATERIAIS e clique no sinal de mais na janela SELEÇÃO.
Por fim, clique em 3D de calo mineralizado na janela MATERIAIS. As imagens de micro-TC analisadas em três momentos mostraram a formação substancial de calo mineralizado no 14º dia. Aumentos incrementais no volume da fração óssea e na densidade mineral óssea foram observados à medida que a cicatrização prosseguiu do 14º ao 21º e 28º dia, consistente com a ponte óssea do gap da fratura.
Como esperado, o calo sofreu reabsorção ou remodelamento entre os dias 21 e 28, evidenciado pelo declínio do volume total de calos. A ponte cortical do calo foi mais evidente no dia 28 do que em qualquer momento anterior. Para fraturas complexas, recomendamos revisar cuidadosamente a segmentação semi-automatizada resultante, percorrendo todos os cortes de imagem, às vezes em planos diferentes, e ajustando os contornos, se necessário.
Uma vez segmentado com precisão o calo da fratura, os parâmetros de resultado, além dos relatados neste protocolo, podem ser computados com scripts adicionais. Estes incluem, por exemplo, momentos de inércia e densidade de conectividade.
