Questo metodo è utile per determinare l'energetica cellulare, come il tasso di produzione di ATP, e anche per determinare la preferenza cellulare verso un particolare metabolita in tempo reale. Per iniziare, aggiungere 200 microlitri di calibrante XF e incubare la piastra di utilità per almeno un'ora prima del test. Preparare 80 millilitri di supporti di analisi XF utilizzando XF DMEM integrato.
Scongelare oligomicina A, rotenone e antimicina A sul ghiaccio. Pipettare i composti su e giù per solubilizzarli prima dell'uso. Aggiungere tre millilitri di mezzo di saggio preparato a ciascun tubo, etichettati A e B.Aggiungere 26,4 microlitri di oligomicina A da 2,5 millimolari nel tubo A e 3,1 microlitri di 12,67 millimolare rotenone, 4,1 microlitri di antimicina A millimolare e 30 microlitri la colorazione di Hook nel tubo B.Caricare una concentrazione 10x di questi inibitori nella porta di iniezione corrispondente.
E infine, 20 microlitri di questi composti saranno caricati nelle cellule in 200 microlitri di mezzi di analisi. Rimuovere la micropiastra di coltura cellulare dall'incubatore a 37 gradi Celsius e osservare le cellule al microscopio. Rimuovere il mezzo di analisi dal bagno d'acqua.
Lavare delicatamente le cellule con 200 microlitri di mezzo di saggio preriscaldato due volte e aggiungere 200 microlitri di mezzi di saggio per pozzetto. Controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che le cellule rimangano aderenti ai pozzetti. Assicurarsi che le celle nei pozzetti D5 ed E8 siano rispettate con un monostrato coerente e non siano state lavate via durante la fase di lavaggio.
Il software di imaging cellulare utilizza questi due pozzetti per impostare la messa a fuoco automatica e l'esposizione automatica. Aprire il software desktop nel computer accanto all'apparecchiatura. Controllare lo stato della connessione nell'angolo in basso a sinistra del software del controller.
Vai a Modelli e seleziona il modello di analisi della velocità ATP XF o il modello di test appropriato. Selezionare Definizioni di gruppo nella parte superiore dello schermo e definire i gruppi. selezionare il layout della mappa delle piastre e assegnare i pozzetti in base ai gruppi definiti.
Verificare il protocollo dello strumento. Assicurarsi che i composti aggiunti siano elencati correttamente e includere le informazioni sul progetto per i riferimenti futuri. Fare clic su Esegui test.
Ciò richiederà la selezione del percorso di archiviazione del file dei risultati. Selezionare il percorso in cui salvare il file dei risultati. Salvare il file con la data del test e fare clic su Avvia esecuzione.
Posizionare la cartuccia del sensore e la piastra di utilità sul vassoio e fare clic su Sono pronto per avviare la calibrazione. Aprire il software di imaging cellulare sul computer. Assicurarsi che l'imager micropiastra sia acceso e che le porte siano collegate al computer.
Controllare la barra di stato in basso a sinistra dello schermo per assicurarsi che la temperatura sia impostata su 37 gradi Celsius e che lo stato della connessione sia evidenziato in verde come pronto. Eseguire la scansione del codice a barre della piastra per avviare il processo di imaging. Fornisci un nome alla piastra cellulare e premi Salva.
Le immagini Brightfield e fluorescenti verranno salvate qui. Fare clic su Esegui scansione Brightfield e, nella schermata successiva, Plate e Scan Menu mostrano le opzioni per l'imaging. Prima del test, selezionare Avvia scansione Brightfield.
Posizionare la micropiastra di coltura cellulare e il coperchio della piastra sul supporto del vassoio e allineare bene A1 con il marchio A1. Fare clic su Chiudi vassoio. L'acquisizione di immagini Brightfield viene visualizzata nella schermata successiva con una mappa delle lastre.
Fare clic su Scan All Wells e scansionare per 30-35 minuti. Al termine della calibrazione, il software visualizza la finestra di dialogo Load Cell Plate. Quindi, fare clic su Apri vassoio per sostituire il vassoio di utilità con una micropiastra di coltura cellulare.
Si noti che la piastra di coltura cellulare si trova nell'imager micropiastra. Dopo la scansione, rimuovere la micropiastra di coltura cellulare e posizionarla nell'analizzatore per eseguire il test. Quindi, fare clic su Load Cell Plate per avviare il test.
Attendere l'avvio del test e visualizzare il tempo di completamento stimato. Al termine del test, il software visualizza la finestra di dialogo Scarica cartuccia sensore e piastra cellulare. Fare clic su Espellere e rimuovere la micropiastra di coltura cellulare dall'analizzatore.
Rimuovere con attenzione la cartuccia del sensore e sostituire il coperchio della piastra cellulare. Viene visualizzata la finestra di dialogo Analisi completa. Quindi, fare clic su Visualizza risultati per aprire il file dei risultati del test o per normalizzare i dati.
Dopo il completamento del test, eseguire la scansione del codice a barre della piastra con il lettore di codici a barre portatile. Se la targa è già stata fotografata, non richiederà un nuovo nome. Selezionare Fluorescenza e Conteggio celle.
Posizionare la piastra cellulare sul supporto del vassoio e fare clic su Chiudi vassoio. Nella finestra di acquisizione delle immagini, selezionare Scansiona tutti i pozzetti per iniziare l'imaging. Esamina le immagini fluorescenti e i conteggi cellulari nell'applicazione di imaging e imaging cellulare facendo clic in modo casuale su un paio di pozzetti.
Una volta completata l'imaging a fluorescenza, esportare le immagini per ulteriori riferimenti. Una volta completata l'imaging e il conteggio delle cellule, apri il file dei risultati e fai clic su Normalizza. Fare clic su Importa e selezionare Applica per il software desktop per normalizzare automaticamente il test con il conteggio delle celle.
L'iniezione di oligomicina A e miscela di fattori di stress FCCP ha aumentato l'attività basale del gruppo di controllo. I fattori di stress hanno mostrato un livello di energia significativamente elevato nel controllo e nel trattamento di un gruppo. D'altra parte, il trattamento due aveva un'attività basale relativamente più bassa e le cellule diventavano più aerobiche.
La figura indica che sia le cellule di controllo che quelle sperimentali utilizzano la glicolisi e la fosforilazione ossidativa mitocondriale per la generazione di ATP. Il gruppo sperimentale mostra una riduzione della generazione di ATP attraverso la glicolisi e un aumento della respirazione mitocondriale. La frequenza respiratoria basale nel gruppo di trattamento è relativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo.
I tassi di respirazione e produzione di ATP in entrambi i gruppi sono diminuiti, insieme alla perdita di protoni seguita da un'iniezione di oligomicina A. I tassi di respirazione delle cellule risalgono di nuovo alla loro respirazione massima dopo l'iniezione di FCCP. L'iniezione finale di rotenone e antimicina A diminuisce nuovamente l'OCR.
Dopo la terza iniezione, la respirazione mitocondriale viene interrotta dalla combinazione di rotenone e antimicina A.Rispetto al gruppo di controllo, la respirazione basale e massimale dei gruppi di trattamento non ha relativamente alcun cambiamento. La figura mostra che il gruppo di controllo è altamente dipendente dalla via del glucosio, mentre l'ossidazione della glutammina era efficiente nel gruppo di controllo. La via degli acidi grassi mostra che il trattamento ha aumentato la capacità complessiva delle cellule.
La disponibilità di più porte di iniezione sulla piastra acida ci aiuta a determinare l'effetto di più farmaci sull'energetica cellulare in un singolo punto temporale.
