Questo protocollo consente l'identificazione e l'isolamento dei progenitori eritroidi BFU-E e CFU-E direttamente dal tessuto di topo appena raccolto come midollo osseo e milza. Usando questa tecnica, possiamo isolare popolazioni pure di progenitori eritroidi, cosa che non era possibile con i precedenti protocolli di flusso. Questo metodo migliora notevolmente la nostra capacità di studiare modelli murini di malattia eritroide consentendo l'isolamento dei progenitori per molti esperimenti a valle.
Per iniziare, posizionare i femori e la tibia appena sezionati direttamente nel tampone colorante freddo o SB-5 e mantenere i tubi sul ghiaccio fino al momento di estrarre il midollo osseo. Metti una malta sterilizzata pulita sul ghiaccio in un secchio e trasferisci le ossa nel mortaio. Usando le forbici da dissezione, tagliare circa 1 millimetro di estremità di ciascun osso.
Utilizzare una siringa da 3 millilitri dotata di un ago da 26 gauge contenente SB-5 per lavare il midollo dalle ossa e raccoglierlo nel mortaio e ripetere il processo da 3 a 5 volte usando un tampone fresco ogni volta fino a quando le ossa appaiono incolori. Filtrare il midollo lavato attraverso una maglia di 100 micrometri e raccogliere le cellule in un tubo da centrifuga da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Quindi, utilizzare il mortaio e il pestello per schiacciare le ossa arrossate in 5-10 millilitri di SB-5.
Filtrare la miscela di ossa frantumate e tamponare attraverso il filtro cellulare da 100 micrometri per raggruppare le cellule precedentemente raccolte. Installare un filtro a maglie da 100 micrometri su un tubo di centrifuga vuoto da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Posizionare una singola milza sul filtro a rete e aggiungere da 0,5 a 1 millilitro di SB-5 alla milza per assicurarsi che non si asciughi.
Utilizzando il lato in gomma di uno stantuffo per siringhe da 3 o 5 millilitri, schiacciare la milza attraverso la rete. Aggiungere più SB-5, 5 millilitri alla volta, e continuare a schiacciare fino a quando tutte le cellule sono state raccolte nel tubo. Preparare una sospensione a cella singola pipettando su e giù le celle raccolte con 2 millilitri di SB-5 utilizzando una grande punta dell'orifizio.
Colorare la fluorescenza meno uno o i controlli FMO aggiungendo tutti gli anticorpi tranne l'omonimo anticorpo FMO alla sospensione cellulare nel tubo FACS. Per colorare i controlli monocolore, aggiungere un singolo anticorpo alla sospensione cellulare nel tubo FACS. Vortice ogni tubo di controllo per 2 o 3 secondi a 3000 RPM e poi incubare a 4 gradi Celsius oscillando per 2,5 ore al buio.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule con SB-5 e aumentare il volume della sospensione cellulare a 4 millilitri con SB-5. Ruotare le cellule a 900 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius e aspirare il surnatante. Risospendere i controlli non colorati e tutti i controlli monocolore in 300 microlitri di SB-5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 micrometri in nuovi tubi FACS.
Crea una soluzione DAPI SB-5 diluendo lo stock DAPI in un rapporto da 1 a 10.000 in SB-5. Risospendere l'FMOS in 1,8 millilitri di DAPI SB-5 e il controllo monocolore DAPI in 300 microlitri di DAPI SB-5, quindi filtrarli attraverso una rete filtrante da 40 micrometri in nuovi tubi FACS. Dopo aver aggiunto la miscela principale di anticorpi a ciascun campione, vortice le provette per 2 o 3 secondi a 3000 giri / min seguita da incubazione a 4 gradi Celsius al buio per 2,5 ore in condizioni di oscillazione.
Dopo aver lavato le cellule come dimostrato in precedenza, risospendere i campioni in 1,8 millilitri di DAPI SB-5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 micrometri in una nuova provetta FACS e analizzare i campioni utilizzando un cistometro. Utilizzare la dispersione diretta per rimuovere i detriti in base alle dimensioni, quindi utilizzare l'istogramma dell'altezza di dispersione in avanti rispetto all'istogramma dell'area di dispersione diretta per escludere gli aggregati di celle e selezionare singole celle. Ripetete l'esclusione con l'altezza di dispersione laterale rispetto all'istogramma dell'area di dispersione laterale.
Escludere le cellule morte eliminando le celle positive per DAPI. Selezionare il ligname negativo TUR uno 19 negativo kit celle positive. E da questi selezionare una sottopopolazione che esprime CD 55.
Suddividere il lignaggio negativo TUR uno 19, kit negativo, positivo, cellule CD 55 positive in 2 popolazioni principali, P sei e P sette in base all'espressione di CD 49 F e CD 1 0 5. Ora, sulla base dell'espressione di CD 150 e CD 41, suddividere ulteriormente P 6 in P 3, P 4 e P 5. Allo stesso modo, sulla base dell'espressione di CD 150 e CD 71, suddividere ulteriormente P 7 in BFUE, CFUE precoce e CFUE tardiva.
Nel presente studio, sono state identificate unità di scoppio e formazione di colonie dalle cellule del midollo osseo e della milza appena raccolte. Dopo 72 ore di eritropoietina, o iniezione di veicolo nei topi, la stimolazione dell'eritropoietina ha mostrato un'espansione delle popolazioni di unità di formazione di colonie precoci e tardive P 1 basse e P 1 alte nel midollo osseo raccolto e nelle cellule della milza. La risposta dei progenitori del midollo osseo e della milza all'eritropoietina in vivo ha anche mostrato un numero più elevato di cellule nelle popolazioni di unità di formazione delle colonie precoci e tardive P 1 basse e P 1 alte, rispetto al controllo del veicolo.
È molto importante generare una singola sospensione cellulare prima di marcare le cellule con anticorpi. Ciò può essere ottenuto pipettando ripetutamente su e giù e includendo EDTA nel buffer. I progenitori purificati possono essere utilizzati per qualsiasi analisi cellulare e molecolare a valle.
Ad esempio, trascrittomica a singola cellula, atesque, saggi di colonia e biochimica. Questa tecnica ci ha aiutato a testare le previsioni degli esperimenti di RNA-seq a singola cellula.
