Il protocollo consente ai ricercatori di misurare simultaneamente la risposta al calcio nelle cellule T primarie insieme alla valutazione del loro sottogruppo e fenotipo di superficie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che evita la necessità di isolare specifici sottoinsiemi di cellule prima di esaminare le loro risposte al calcio. Per iniziare, preparare una soluzione madre di un microgrammo per microlitro di Indo-1 AM aggiungendo 50 microlitri di DMSO in una fiala contenente 50 microgrammi di Indo-1 AM. Diluire la soluzione madre in un volume appropriato di cRPMI e una concentrazione di sei microgrammi per millilitro.
Posizionare il mezzo a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Quindi utilizzare questo mezzo per diluire una sospensione cellulare precedentemente preparata con un rapporto uno-a-uno per ottenere da cinque a 6 milioni di cellule per millilitro. Successivamente, a una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare per pozzetto per condizione sperimentale.
Preparare un singolo campione di controllo colorato per Indo-1 privo di calcio aggiungendo EGTA alle celle caricate con colorante Indo-1. Preparare un pozzo per il controllo biologico negativo senza fluorofori o colorante Indo-1. Preparare un controllo positivo Indo-1 aggiungendo ionomicina ad una concentrazione di 50 micromoli alla sospensione cellulare caricata di colorante al citometro a flusso.
Inoltre, preparare un pozzo per i controlli a singola colorazione per ulteriori popolazioni cellulari utilizzando fluorofori coniugati con anticorpi. Quindi aggiungere due microgrammi di anticorpo bloccante del recettore FC per milione di cellule e incubare la piastra per 45 minuti con picchiettamento ogni 15 minuti per risospendere le cellule. Dopo l'incubazione, mescolare e rimuovere l'intero volume di cellule dalla piastra e aggiungerlo a tubi di microcentrifuga da 1,7 millilitri.
Centrifugare e decantare il surnatante. Una volta lavate le celle con un millilitro di cRPMI preriscaldato, pellettare nuovamente e decantare il surnatante. Risospendere le cellule in un millilitro di cRPMI e incubare ogni tubo, lasciando la parte superiore del tubo leggermente aperta per lo scambio di gas, consentendo la completa deesterificazione degli esteri AM intracellulari.
Quindi, preparare un master mix di tutti gli anticorpi coniugati al fluorocromo definiti dall'utente e aggiungerlo alle cellule a riposo per un millilitro del volume cellulare. Dopo il riposo, pellet le celle e lavare il pellet riassumendo in un millilitro di cRPMI raffreddato a quattro gradi Celsius. Ripetere questo passaggio e posizionare i tubi sul ghiaccio.
Risospendere i singoli campioni in 500 microlitri di cRPMI privo di rosso fenolo utilizzando un tubo di flusso in polistirene da cinque millilitri con un tappo. Per mantenere la temperatura utilizzando l'analisi del flusso di calcio, preparare un bagno di perline aggiungendo perline da bagno a un piccolo bagno d'acqua e riscaldarlo fino a 37 gradi Celsius. Tagliare con cura un tubo cronaca da 50 millilitri a metà e scartare la parte superiore del tubo.
Riempire tre quarti del tubo rimanente con perline da bagno e lasciarlo raggiungere i 37 gradi Celsius nel bagno di perline. Posizionare il bagno di perline vicino a un citometro a flusso, insieme a un rack di polistirolo per posizionare il tubo. Prima dell'analisi sul citometro a flusso, riscaldare i tubi individualmente a 37 gradi Celsius per sette minuti.
Accedere al software del citometro a flusso e fare clic sulla scheda Libreria. Quindi selezionare i tag fluorescenti per aggiungere Indo-1 legato al calcio e Indo-1 privo di calcio. Quindi selezionare il laser UV sotto i gruppi di tag fluorescenti e fare clic su Aggiungi per aggiungere un nome di tag fluorescente.
Scegliere la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione laser, quindi fare clic su Salva. Continuare con la configurazione sperimentale. Fare clic sulla scheda Acquisizione, Apri/Crea un nuovo esperimento e aggiungere i tag fluorescenti desiderati all'esperimento.
Creare un gruppo di riferimento e un nuovo gruppo di esempio per l'esperimento ed etichettare entrambi i gruppi. Nella scheda Acquisizioni, impostare gli eventi in modo che vengano registrati al massimo a 10 milioni, arrestando il volume al volume massimo di 3000 microlitri e il tempo di arresto al massimo su 36.000 secondi. Acquisire controlli a colorazione singola per anticorpi coniugati definiti dall'utente inclusi nel pannello multicolore e per colorante funzionale Indo-1.
Aggiungere 50 micromoli di ionomicina al controllo positivo e al vortice Indo-1 legato al calcio. Aggiungere il tubo di flusso alla scheda di iniezione del campione e fare clic su Registra. Quindi aggiungere il controllo negativo Indo-1 privo di calcio al citometro a flusso e fare clic su Registra.
Svuotare i controlli a macchia singola facendo clic sul pulsante Unmix. Una volta completata la miscelazione, creare grafici sequenziali utilizzando il foglio di lavoro non miscelato, ad esempio SSC-A rispetto a FSC-A, per rimuovere i detriti dal campione e SSC-A rispetto a SSC-H per rimuovere doppietti. Quindi crea porte facendo clic su Plot.
Aggiungi un grafico al foglio di lavoro e fai doppio clic all'interno del cancello per creare una popolazione gated a valle. Continuare fino a quando tutte le popolazioni di interesse sono contabilizzate. Quindi, riscaldare i campioni di controllo a 37 gradi Celsius per l'analisi sequenziale.
Impostare il software di citometria a flusso ed eseguire DI in acqua ghiacciata per due o tre minuti per garantire la stabilità fluidica del citometro a flusso. Impostare grafici sequenziali nel foglio di lavoro non misto creando porte utilizzando i pulsanti del rettangolo poligonale o del cancello dell'ellisse per includere la popolazione di interesse. Fate doppio clic all'interno del gate e modificate i parametri degli assi y e x impostandoli su SSC-A anziché SSC-H.
Completate la definizione dei parametri dell'asse facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sull'asse. Creare un grafico con SSC-A rispetto al segnale di colorante di vitalità. Cancellare le cellule vive che sono negative per la colorazione del colorante amminico.
Le celle vive negative per la colorazione dei morti vivi si raggrupperanno al segno zero sia sull'asse y che sull'asse x. Fare doppio clic sul grafico interno per creare un nuovo grafico contenente solo linfociti vivi a singola cellula. Modificare l'asse Y in Indo-1 rispetto al tempo sull'asse x per visualizzare l'afflusso di calcio.
Quindi posizionare il campione biologico riscaldato nel SIT della macchina. Esegui i campioni a 2.500-3000 eventi al secondo su una portata media per visualizzare l'afflusso di calcio in un numero limitato di popolazioni cellulari. Aggiungere il tubo successivo al bagno di perline nel controllo dell'acquisizione.
Premere Record per registrare i dati iniziali per 30 secondi per ottenere un livello basale di segnalazione del calcio nel campione. Quindi fare clic su Stop e rimuovere il tubo dalla porta di iniezione del campione. Aggiungere 30 microgrammi di anti-CD3 non coniugato direttamente nella provetta per avviare l'afflusso di calcio.
Riposizionare rapidamente il tubo sulla porta di iniezione del campione e premere Record nel software. Registra i dati per sette minuti, osservando il tempo trascorso sotto i controlli di acquisizione nel software. Quindi premere Stop nel software.
Aggiungere un microgrammo per millilitro di ionomicina e registrare per 30 secondi per ottenere il massimo segnale di calcio nelle cellule di interesse. Passare all'esempio successivo e ripetere il flusso di lavoro fino a quando non sono stati raccolti tutti i campioni. Salva l'esperimento e fai clic sul file zip di esportazione.
I file non misti vengono caricati su un software di analisi citometrica a flusso esterno. Un segnale stabile e coerente in un grafico di tempo rispetto alla dispersione laterale indicava stabilità fluidica. La popolazione di linfociti è stata controllata seguita dalla discriminazione dei singoletti su un appezzamento di altezza di dispersione laterale rispetto all'area.
I singoletti sono stati valutati per la vitalità. Quindi è stato applicato il gating sulla popolazione CD19-negativa. Questi sottogruppi di cellule T sono stati valutati utilizzando anticorpi contro CD4 e CD8 visualizzando la fluorescenza Indo-1 legata al calcio rispetto al tempo.
Nelle singole popolazioni cellulari, il grafico di Indo-1 legato al calcio rispetto al tempo ha mostrato una linea di base prima della stimolazione. Una risposta di picco quando i livelli di calcio intracellulare sono diminuiti e la risposta al calcio ha suscitato l'aggiunta di ionomicina. Prima dell'aggiunta di anticorpi anti-CD3, è stato rilevato un debole segnale Indo-1 legato al calcio.
Durante la risposta di picco, le cellule hanno mostrato un forte segnale Indo-1 legato al calcio e un ridotto Indo-1 privo di calcio. A cinque minuti dal picco, la fluorescenza Indo-1 è quasi tornata al basale. Dopo l'aggiunta di ionomicina, è stato visualizzato un robusto segnale di Indo-1 legato al calcio, che indica un adeguato carico di colorante delle cellule.
L'analisi delle popolazioni rare è stata eseguita tracciando l'Indo-1 legato al calcio rispetto all'Indo-1 privo di calcio dopo aver individuato ciascuna popolazione di interesse. E analizzando la risposta del calcio durante l'intero corso temporale per ciascun sottoinsieme. Il flusso di calcio utilizzando la profilazione a spettro completo può portare ad un'analisi citometrica a flusso ad alto parametro in una varietà di sottogruppi immunitari.
L'analisi ad alta dimensionalità per il clustering imparziale di sottoinsiemi di cellule T può essere utilizzata in combinazione con citometria a flusso ad alto parametro per analisi avanzate. Questa tecnica è sviluppata per l'analisi di più sottogruppi immunitari in combinazione tra loro in un campione di massa.
