Il nostro protocollo prevede un metodo di inoculazione ed estrazione delicata delle piante che consente di recuperare popolazioni batteriche cresciute nell'apoplasta fogliare adatto per l'analisi dell'espressione genica unicellulare come la citometria a flusso. Questo metodo consente l'estrazione di una notevole quantità di batteri dall'apoplast senza contaminare significativamente i campioni con detriti cellulari vegetali. Questo metodo ottimizzato per il recupero dei batteri apoplastici può essere applicato direttamente o con piccole modifiche a un certo numero di sistemi batterici vegetali che comprendono batteri patogeni delle piante o batteri endocitici benefici.
A dimostrare la procedura sarà Nieves Lopez-Pagan, una dottoranda del nostro laboratorio. Per iniziare, riempi un vaso di 10 centimetri di diametro con una miscela di substrato vegetale 1: 3 precedentemente irrigato. Coprire la pentola con una rete metallica perforata e regolare la rete metallica sul terreno bagnato usando un elastico.
Quindi, seminare semi di Arabidopsis nei fori della rete metallica con uno stuzzicadenti bagnato. Metti tre o quattro semi in posizioni distanti all'interno del vaso. Coprire la pentola con una cupola di plastica per mantenere alta l'umidità relativa e incubare per la stratificazione a quattro gradi Celsius per 72 ore.
Trasferire il vaso in una camera di crescita delle piante in condizioni di breve durata. Per scoprire la pentola, rimuovere la cupola di plastica. Una volta che i semi sono germinati, utilizzare le pinzette per rimuovere la maggior parte delle piantine, mantenendo una piantina in ciascuna delle posizioni del vaso.
Quindi preparare le piante di fagioli Phaseolus vulgaris coprendo il fondo di una capsula di Petri con un pezzo di carta assorbente bagnato e posizionando i semi di fagioli sopra di esso. Sigillare la capsula di Petri con nastro chirurgico e incubare a 28 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Trasferire i semi germinati in un vaso di 10 centimetri di diametro riempito con una miscela di substrato vegetale di vermiculite 1:3 bagnata e incubare in una camera di crescita delle piante in condizioni di lunga giornata.
Strisciare lo stock di glicerolo del ceppo di interesse di Pseudomonas syringae da meno 80 gradi Celsius in una piastra LB integrata con gli antibiotici appropriati. Incubare la piastra a 28 gradi Celsius per 40-48 ore. Raschiare la biomassa batterica e risospenderla in cinque millilitri di cloruro di magnesio da 10 millimolari.
Misurare la densità ottica a 600 nanometri e regolarla a 0,1 aggiungendo cloruro di magnesio 10 millimolare. Eseguire diluizioni seriali in cloruro di magnesio 10 millimolari per ottenere una concentrazione finale di inoculo di cinque volte 10 al quinto CFU per millilitro. Quindi, preparare 200 millilitri di inoculo per le piante di Arabidopsis e 50 millilitri per le piante di fagioli.
Prima dell'inoculazione, aggiungere il tensioattivo Silwet L-77 ad una concentrazione finale dello 0,02% per l'inoculazione dei fagioli e dello 0,01% per l'Arabidopsis. Per l'infiltrazione di Arabidopsis, posizionare due bastoncini di legno che formano una X sopra la pentola e posizionare la pentola rivolta verso il basso su una capsula di Petri di 14 centimetri di diametro contenente 200 millilitri di inoculo. Per l'inoculazione delle foglie di fagiolo, inserire le piante e la soluzione di inoculo in una camera a vuoto e introdurre la foglia in un tubo di centrifuga conica da 50 millilitri contenente l'inoculo.
Dare un impulso di 500 millibar per 30 secondi per infiltrarsi nelle foglie. Scolare la soluzione di inoculo in eccesso con un pezzo di carta e riportare i piani nella camera di crescita corrispondente. Quattro giorni dopo l'inoculazione, tagliare la parte aerea della pianta di Arabidopsis o la foglia inoculata dalla pianta di fagioli e metterla in una siringa da 20 millilitri senza ago.
Per le foglie di fagioli, arrotolare la foglia su se stessa, lasciando la faccia abassiale verso l'esterno. Aggiungere un volume sufficiente di acqua distillata per coprire il tessuto. Quindi, inserire lo stantuffo che tiene la siringa in posizione verticale e rimuovere l'aria in eccesso e le bolle d'aria all'interno della siringa picchiettando delicatamente il cilindro fino a quando tutta l'aria si trova vicino alla punta e, dopo aver rimosso l'aria, coprire la punta del cilindro della siringa con pellicola di paraffina.
Ora premere con attenzione lo stantuffo per generare una pressione positiva fino a quando il tessuto diventa più scuro. Quindi, tirare lo stantuffo per generare una pressione negativa. Rimuovere la pellicola di paraffina e lo stantuffo e raccogliere il fluido contenente i batteri estratti dall'apoplasto.
Per un'analisi a cella singola, preparare una soluzione di agarosio all'1,5% in acqua distillata. Una volta sciolto, aggiungere un volume sufficiente a riempire lo spazio tra due vetrini da microscopia affiancati e posizionare un altro vetrino sopra. Lasciateli guidare per 15 minuti e rimuovete con attenzione la slitta posta sulla parte superiore.
Usando una lama, tagliare il cuscinetto di agarosio in pezzi di cinque millimetri per cinque millimetri prima dell'uso. Parallelamente, centrifugare un millimetro dei batteri estratti dall'apoplasto. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in 20 microlitri di acqua per concentrare le cellule.
Posizionare una goccia da due microlitri delle cellule concentrate su un vetrino di copertura da 0,17 millimetri e coprire la goccia con un pezzo di tampone di agarosio. Visualizza la preparazione batterica al microscopio confocale per identificare i batteri fluorescenti verdi utilizzando laser specifici. Identifica tutti i batteri usando il campo luminoso e unisci entrambi i campi.
Per eseguire l'analisi mediante citometria a flusso, prendere un'aliquota delle sospensioni batteriche estratte dall'apoplasto. Analizza utilizzando il citometro a flusso e acquisisci 100.000 eventi. L'espressione della GFP hrpL è monitorata dalla fluorescenza della GFPL.
I grafici dot plot mostrano la distribuzione dell'intensità di fluorescenza della GFP rispetto alla dimensione delle cellule nella popolazione, mentre gli istogrammi mostrano l'intensità di fluorescenza della GFP rispetto alla conta cellulare. Le percentuali di hrpL ON erano superiori alle corrispondenti percentuali di hrpL OFF. Le immagini al microscopio a fluorescenza mostrano livelli eterogenei di GFP associati all'espressione di hrpL.
Si osservano i batteri che mostrano una fluorescenza GFP bassa o assente. Per risultati ottimali, sii delicato durante le fasi di estrazione dei batteri per evitare di danneggiare il tessuto vegetale e quindi limitare la contaminazione dal contenuto cellulare della pianta. I campioni di batteri ottenuti possono essere utilizzati per altri scopi in cui la riduzione della contaminazione delle piante è un vantaggio, come le estrazioni di acidi nucleici per successive analisi genomiche o trascrittomiche batteriche.
