Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come schermare i soppressori silenziatori dell'RNA secreti dagli agenti patogeni delle piante. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di fornire un saggio di screening rapido, accurato ed esteso per l'identificazione dei soppressori di silenziamento dell'RNA. Preparare miscele di terreno invaso composte per il 50% da muschio di torba, 30% perlite e 20% vermiculite e autoclave a 120 gradi Celsius per 20 minuti.
Immergere le miscele di terreno autoclavato con la soluzione di fertilizzante vegetale a un grammo per litro e sottoconfezionarle in vasi più piccoli conservati in un vassoio più grande. Seminare uno o due semi di Nicotiana bethamiana 16c sulla superficie del suolo di ogni pentola. Coprire il vassoio con una cupola di plastica e lasciare germogliare i semi.
Posizionare il vassoio sotto camere di crescita leggere e a temperatura controllata con una temperatura da 23 a 25 gradi Celsius, umidità relativa dal 50 al 60% e un fotoperiodo di una lunga giornata. Dopo tre o quattro giorni, i semi germinano. Togliere la cupola di plastica e lasciare che le piantine crescano nelle stesse condizioni utilizzate per la fase di germinazione.
Ogni due o tre giorni, aggiungere una quantità appropriata di acqua mantenendo il terreno umido ma non in ammollo. Ogni 10 giorni, aggiungi fertilizzante per promuovere un'ulteriore crescita. Mantenere nicotiana bethamiana 16c piante in condizioni normali fino a quando le piante hanno almeno cinque foglie vere completamente sviluppate senza ascellare visibile o boccioli di fiori e le foglie hanno un aspetto verde sano.
Usa piante Nicotiana bethamiana 16c di 10-14 giorni per saggi di silenziamento sistemico dell'RNA e foglie da tre a quattro settimane di Nicotiana bethamiana 16c per i test di silenziamento dell'RNA locale. Utilizzare una punta per raccogliere una colonia positiva dalla piastra LB e inoculare le cellule in un tubo di vetro contenente cinque millilitri di mezzo LB integrati con 50 microgrammi per millilitro Kanamicina e 50 microgrammi per millilitro Rifampicin. Far crescere le cellule a 30 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min per 24-48 ore.
Trasferire 100 microlitri della coltura in cinque millilitri di mezzo LB integrati con gli stessi antibiotici, MES da 10 millimolare a pH 5,6 e 20 micromolare AS. Far crescere i batteri a 30 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min per 16-20 ore. Centrifugare le cellule a 4.000 volte g per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in due millilitri di tampone di cloruro di magnesio millimolare.
Ripetere il lavaggio per garantire la completa rimozione degli antibiotici. Determinare la densità della coltura di Agrobacterium misurando la densità ottica a 600 nanometri. Regolare la coltura cellulare con tampone di cloruro di magnesio millimolare da 10 millimolare a un OD 600 da 1,5 a 2,0.
Aggiungere 10 MES millimolare a pH 5.6 e 150 micromolare AS alla coltura finale della sospensione e incubare le cellule a temperatura ambiente per almeno tre ore senza tremare. Mescolare volumi uguali di una coltura di Agrobacterium contenente proteine fluorescenti verdi 35S con una coltura di Agrobacterium contenente soppressore del virus del mosaico di cetrioli 35S 2b, effettore putativo o vettore vuoto. Utilizzando una siringa senza ago millilitro, infiltrarsi con cura e lentamente nelle sospensioni miste di Agrobacterium sui lati abaxiali delle foglie di Nicotiana bethamiana 16c.
Rimuovere la sospensione batterica rimanente dalle foglie con salviette dei tessuti molli e cerchiare i margini delle macchie infiltrate con una penna marcatore. Da tre a quattro giorni dopo l'infiltrazione, usa una lampada ultravioletta a onde lunghe per rilevare visivamente la fluorescenza GFP nelle macchie infiltrate di foglie. Due settimane dopo l'infiltrazione, utilizzare la lampada per rilevare le foglie appena coltivate dell'intera pianta per il silenziamento sistemico dell'RNA.
Per isolare l'RNA totale dal tessuto fogliare a quattro o sette giorni dopo l'infiltrazione, raccogliere i tessuti fogliari dalle macchie infiltrate di Nicotiana bethamiana 16c in un mortaio. Mettere l'azoto liquido nella malta e macinare il tessuto in una polvere fine con un'asta di macinazione e trasferire la polvere in un tubo sterile a due millilitri. Aggiungere immediatamente il reagente di isolamento dell'RNA al volume di un millilitro per 100 milligrammi di tessuto al tubo campione in una cappa, vortice vigorosamente per omogeneizzare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Aggiungere cloroformio al volume di 200 microlitri per un millilitro di reagente di isolamento dell'RNA a ciascun tubo della cappa, agitare vigorosamente per 15 secondi e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare l'omogeneato a 12.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo privo di RNasi e scartare il pellet.
Aggiungere 0,7 volume di isopropanolo al supernatante, invertire delicatamente più volte e incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti. Precipitare il pellet di RNA per centrifugazione a 12.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante.
Lavare il pellet con il 70% di etanolo e asciugare ad aria il pellet in una cappa. Sciogliere l'RNA in acqua trattata con pirocarbonato dietile incubando in un bagno d'acqua di 65 gradi Celsius per 10-20 minuti. Per eseguire l'analisi northern blot dei livelli di RNA messaggero GFP, preparare un gel di agarosio denaturante dell'1,2% in tampone di funzionamento 1X MOPS.
Mescolare l'RNA uno a uno con colorante di carico dell'RNA e denaturare l'RNA per incubazione a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Raffreddare immediatamente i campioni denaturati sul ghiaccio per un minuto. Con una pipetta, caricare i campioni nei pozzi del gel e dell'elettroforesco a 100 volt per 50 minuti fino a quando l'RNA non è ben separato.
Risciacquare il gel in tampone di citrato di sodio salino 20X per rimuovere la formaldeide. Eseguire il trasferimento capillare durante la notte impostando un tampone di citrato di sodio salino 20X, uno strato di carta assorbente, due strati di carta Whatman bagnata, uno strato di gel, uno strato di membrana di nylon, due strati di carta Whatman bagnata, due strati di carta Whatman asciutta, una lastra di vetro e un peso. Al mattino, l'RNA nel gel viene trasferito alla membrana di nylon.
Immergere la membrana in citrato di sodio salino 2X e fissare l'RNA alla membrana esponendo la membrana bagnata al reticolo UV. Procedere secondo il manoscritto. Foglie completamente sviluppate di piante Nicotiana bethamiana 16c di tre o quattro settimane sono state co-infiltrate in cerotti con miscele agrobatteriche che trasportavano 35S GFP.
A quattro giorni dalla post-infiltrazione, la fluorescenza GFP dell'area infiltrata è stata immagine sotto la luce naturale e la luce UV a onde lunghe. Northern blot ha rivelato che l'RNA messaggero GFP si è accumulato più in alto nelle foglie esprimendo 35S GFP più 35S CMV2b o 35S GFP più 35S PSR1 che nelle foglie che esprimono 35S GFP più EV. Il saggio di agroinfiltrazione è stato eseguito per valutare la diffusione del segnale silenziante nelle foglie delle piantine Nicotiana bethamiana 16c di due settimane. A 14 giorni dopo l'infiltrazione, più del 98% dell'EV non presentava alcuna segnalazione ovvia della GFP nelle foglie sistemiche.
Mentre sia CMV2b che PSR1 inibivano efficacemente la diffusione sistemica del segnale silenziatore. La fluorescenza della GFP è stata osservata in circa l'80% delle piante co-infiltrate e nel restante 20% delle piante infiltrate con solo poche vene rosse è apparso nelle foglie appena emerse. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per identificare nuovi soppressori silenziatori di RNA secreti da molti patogeni vegetali.
La combinazione di piante e L'OD corretto è la cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura. Seguendo questa procedura, la caratterizzazione funzionale del soppressore di silenziamento dell'RNA può essere eseguita per esplorare il meccanismo di come questi soppressori prevengono il silenziamento dell'RNA host e qual è l'output. Si prega di indossare gli occhiali di sicurezza quando ci si infiltra nelle piante e si indossano anche i guanti in lattice durante tutte le fasi dell'esperimento.
