La coltura cellulare è un'abilità delicata necessaria per la coltivazione di vari tipi di cellule e tessuti in un ambiente di laboratorio controllato. La preoccupazione principale quando si esegue il lavoro di coltura cellulare è la contaminazione. Questa contaminazione può presentarsi sotto forma di batteri, muffe o micoplasma.

Le tecniche e le pratiche descritte in questo video garantiranno che le tue cellule rimangano vitali, sane e prive di contaminazione. Queste pratiche dovrebbero essere rigorosamente rispettate e tutto il personale di laboratorio dovrebbe ricevere una formazione almeno una volta all'anno. Prima di iniziare il lavoro, indossare un camice da laboratorio pulito designato per l'uso solo nella sala di coltura cellulare.

Indossare guanti nuovi che non abbiano toccato altre superfici. Assicurati che i guanti aderiscano perfettamente. I guanti senza polvere di nitrile sono i migliori.

Il camice e i guanti da laboratorio non devono essere sterili. Per prepararsi al lavoro, guanti spray, maniche camice da laboratorio e l'interno dell'armadio di sicurezza biologica con etanolo al 70%. Spruzzare la superficie di lavoro, i lati, il retro, tutti gli oggetti nell'armadio e il pannello frontale in vetro, sia dall'interno che dall'esterno.

Pulire la superficie di lavoro e il pannello di vetro con un tovagliolo di carta privo di lanugine. Prenditi del tempo per organizzare lo spazio di lavoro all'interno dell'armadio. Tenere i bagni d'acqua all'interno della stanza di coltura cellulare e utilizzarli solo per scopi di coltura cellulare, come mezzi di riscaldamento o cellule di scongelamento.

I bagni d'acqua devono essere drenati e lavati una volta alla settimana. Limitare la quantità di oggetti portati nell'armadio e non interrompere il flusso d'aria all'interno dell'armadio di sicurezza biologica bloccando le griglie anteriori o posteriori. Spruzzare tutti gli oggetti posizionati all'interno dell'armadio con etanolo al 70% e asciugarli.

Inizia spruzzando la parte superiore della bottiglia del supporto e procedi verso il basso. Con un tovagliolo di carta pulito, iniziare dalla parte superiore del flacone del supporto per asciugarlo, progressivamente verso il basso. Non risalire verso il tappo.

Il modo in cui funzionano questi armadi è che tirano l'aria dalla stanza e dall'armadio stesso attraverso le griglie anteriore e posteriore. L'aria va verso la parte posteriore del cabinet e fino alla cima. Lì, l'aria contaminata passa attraverso un mucchio di filtri e parte dell'aria pulita filtrata viene spinta verso il basso sull'area di lavoro nell'armadio.

Se l'armadio è abbastanza grande da ospitare pipette sierologiche, possono essere collocate all'interno, altrimenti possono essere conservate in un recipiente montato all'esterno dell'armadio. È buona norma controllare entrambi i lati della pipetta incassata per verificare la presenza di fori, strappi o forature nella confezione prima dell'uso. Non strappare l'involucro.

Invece, sbucciare delicatamente le estremità dell'involucro. Inserire la pipetta sierologica in un ausilio per pipette e rimuovere l'involucro con un movimento fluido. Non passare sopra bottiglie o boccette aperte.

Non è consigliabile raggiungere una bottiglia o un matraccio aperto o lavorare sopra i palloni aperti. Il flusso d'aria all'interno degli armadi spinge verso il basso qualsiasi cosa all'interno. Raggiungere la mano consentirà alla manica o al guanto di essere sopra gli oggetti che potrebbero potenzialmente spingere verso il basso qualsiasi contaminazione presente sulla manica, ad esempio, nella coltura cellulare.

Quando possibile, non versare liquidi. Invece, aggiungili usando una pipetta sierologica. Mescolare accuratamente il contenuto e inizializzare il flacone.

Annota con cosa sono integrati i media. Se stai lavorando con colture aderenti e hai bisogno di una fiaschetta di plastica, spruzza l'intero pacchetto e mettilo dentro. Ogni volta che i guanti si sono asciugati, spruzzarli di nuovo con l'etanolo.

Quando si lavora con una linea cellulare aderente, utilizzare pipette di vetro autoclavate o pipette di plastica sterili monouso per aspirare i fluidi o le soluzioni di lavaggio. Rimuovere con attenzione il tappo metallico dal contenitore di stoccaggio. Isolare una pipetta di vetro agitando delicatamente il contenitore ad angolo.

Quando si raggiunge il contenitore, evitare di toccare altre pipette. Maneggiare la pipetta scelta da una sola estremità. Sostituire rapidamente i tappi su bottiglie e fiaschi il prima possibile.

Posizionare i tappi sul piano di lavoro capovolti in modo che il cerchio non tocchi il piano di lavoro. Non afferrare il cappuccio dall'alto o dal basso. Invece, tocca i tappi dai lati.

Quando si aspirano liquidi, utilizzare un pallone a trappola a vuoto situato all'esterno dell'armadio in un contenitore secondario sul pavimento. I rifiuti verranno creati mentre si lavora all'interno dell'armadio. Poiché muovere le mani dentro e fuori dall'armadio troppo spesso interrompe il flusso d'aria, è bene lasciare temporaneamente eventuali rifiuti all'interno dell'armadio.

Posizionalo di lato in modo che non interrompa il tuo lavoro. Spruzzare generosamente i guanti con etanolo al 70% ogni volta che diventano asciutti. Strofina le mani insieme in modo che non gocciolino bagnate.

Una breve nota sulle pipette sierologiche. Se toccano accidentalmente qualcos'altro nel cappuccio, non esitate a buttarli fuori. È meglio iniziare da zero con una pipetta sierologica pulita invece di usarne una che potrebbe essere contaminata.

Prima di posizionare le cellule nell'incubatore, controllare per vedere come appaiono al microscopio. Devono essere osservate singole cellule. Ciò indica che le celle sono state risospese completamente.

Non parlare, starnutire, tossire o respirare pesantemente nelle incubatrici. Aprire e chiudere rapidamente le porte dell'incubatore. Lasciarli aperti più a lungo del necessario può consentire ai contaminanti presenti nell'aria di entrare negli incubatori.

Assicurarsi che i tappi di tutte le bottiglie siano ben chiusi prima di rimuoverli dall'armadio. I supporti sono sensibili alla luce. Dovrebbe essere conservato al buio a quattro gradi Celsius quando non in uso.

Spruzzare nuovamente l'interno dell'armadio con etanolo al 70% dopo aver completato il lavoro di coltura cellulare e asciugare la superficie con un tovagliolo di carta. Svuotare il sacchetto dei rifiuti a rischio biologico. Ripetere questo processo e sostituire i guanti quando si passa a una linea cellulare diversa.

Quando si lavora con colture di sospensione coltivate in boccette di vetro, assicurarsi che i guanti siano bagnati. Toccare il foglio di alluminio con i guanti bagnati e quindi spruzzare solo il fondo del pallone prima di posizionarlo all'interno dell'armadio di sicurezza biologica. Quando si preleva un campione per il conteggio delle cellule, rimuovere solo un tubo da 1,5 ml dal suo contenitore.

Non toccare nessuno degli altri tubi. Posizionare il cappuccio capovolto sulla superficie di lavoro. Non toccare il bordo interno.

Maneggialo con cura dai lati e sostituiscilo una volta che hai finito. Quando si maneggiano celle di sospensione e palloni di vetro, rimuovere con attenzione il doppio pezzo piegato di foglio di alluminio che copre l'intero collo del pallone. Tirare delicatamente su tutti e quattro gli angoli e posizionare la pellicola capovolta sulla superficie di lavoro.

Maneggiare il matraccio di vetro solo dal basso. Non toccarlo dal collo una volta che la pellicola è spenta. Utilizzare una pipetta sierologica da 1 ml per prelevare un campione per il conteggio delle cellule.

Non lasciare che i media gocciolino lungo il lato dei palloni. Se lo fa, spruzzare un tovagliolo di carta con etanolo al 70% e pulirlo immediatamente. Assicurarsi che i tappi o il foglio di alluminio siano serrati prima di rimuovere bottiglie o boccette dagli armadietti di sicurezza biologica.

Utilizzare incubatori separati per diversi tipi di cellule. Ciò impedirà la contaminazione incrociata di diversi tipi di cellule. Si consiglia di posizionare il pallone a trappola sottovuoto per la raccolta dei rifiuti liquidi al di fuori dell'armadio sul pavimento in un contenitore secondario etichettato come rifiuti.

Il tubo è collegato a un filtro che viene sostituito su base mensile. Il tubo entra attraverso il lato dell'armadio. Rimuovere la spazzatura a rischio biologico una volta completato il lavoro.

Tenere un protocollo di lavaggio del vetro sul muro vicino al lavandino. In primo luogo, immergere le cellule scartate con il 10% di candeggina per circa cinque minuti. Quindi gettare la miscela di candeggina e sciacquare accuratamente il matraccio con acqua.

Aggiungere sapone con acqua, strofinare molto bene con un pennello, risciacquare con altra acqua. E poi il passaggio finale è quello di sciacquare la vetreria con l'acqua DI sul rubinetto a destra. Lavare le borracce di vetro il prima possibile, strofinare bene la vetreria.

Le cellule Sf9 lasceranno questo bordo di cellule morte se non viene lavato correttamente. Utilizzare questi flaconi solo per la coltura cellulare, la vetreria per colture cellulari in autoclave invece di inviarla a un impianto di lavaggio del vetro. Utilizzare il ciclo di vuoto sull'autoclave per 40 minuti di tempo sterilizzato e 40 minuti di tempo di asciugatura.

Tenerlo separato dalla vetreria nell'area principale del laboratorio. Organizzare la sala di coltura cellulare in modo che tutte le forniture si trovino in un'unica area, riducendo così al minimo la necessità per i membri del laboratorio di uscire dalla sala di coltura cellulare in cerca di forniture. Etichettare tutte le bottiglie di plastica utilizzate per raccogliere le cellule e riutilizzate in coltura cellulare in seguito, solo per uso di coltura cellulare.

Utilizzare i flaconi di coltura cellulare designati per un tipo di cellula specifico. Conservare questi flaconi nella stanza di coltura cellulare per un facile accesso. Per le culture che vengono coltivate in sospensione, la muffa sarà riconosciuta come palle galleggianti nei media.

Per quanto riguarda la contaminazione batterica, renderà i media bianchi e torbidi. Allo stesso modo, per le cellule aderenti, la contaminazione da muffa può essere facilmente riconosciuta come chiazze sfocate. La contaminazione batterica diventerà normalmente trasparente, bianca e torbida.

Molte specie di micoplasma possono essere identificate in modo affidabile utilizzando un test basato sulla PCR. La banda a sinistra mostra gli standard di peso molecolare per il DNA. Le quattro bande a destra sono controlli positivi.

Non compaiono bande sotto i tipi di cellule testati perché il micoplasma non è stato rilevato. I terreni di coltura cellulare cambieranno colore da rosso a giallo se sono presenti indicatori di pH. Il colore giallo indica che il pH è basso e il supporto deve essere sostituito.

Se si osservano altre crescite o forme cellulari al microscopio ottico durante l'esecuzione del conteggio delle cellule, questo potrebbe essere un indicatore di contaminazione. Si noti che una pulizia approfondita dell'emocitometro deve essere eseguita prima del conteggio delle cellule poiché questo tipo di detriti può essere presente solo sull'emocitometro e non nella coltura cellulare stessa. Mentre la contaminazione è una delle preoccupazioni principali quando si esegue il lavoro di coltura cellulare, questi rischi possono essere mitigati seguendo le pratiche e le tecniche descritte in questo video.

Se un test mensile del micoplasma viene eseguito ogni mese, il personale di laboratorio viene addestrato su base annuale e queste pratiche sono rigorosamente rispettate, quindi le cellule rimarranno sane e prive di contaminazione. Ciò contribuirà anche a ridurre i costi associati all'acquisto di costosi terreni di coltura cellulare, all'acquisto di nuove cellule e ridurrà i tempi di inattività della decontaminazione dell'incubatore. Ricorda, la chiave per una coltura cellulare di successo è un'azione precoce al fine di prevenire la contaminazione in primo luogo.