Questo protocollo mostra l'uso della microscopia a forza atomica in modalità contatto per osservare i cambiamenti nella morfologia cellulare dovuti a una specifica malattia o trattamento. Si consiglia vivamente di utilizzare contenitori sigillati per questa procedura per evitare la contaminazione e analizzare il campione fisso il prima possibile per evitare l'invecchiamento. Iniziare fissando i campioni sul vetrino passando delicatamente il vetrino su una fiamma più volte fino a quando il campione è asciutto.
Posizionare i campioni fissi in una capsula di Petri e trasportarli all'apparecchiatura del microscopio a forza atomica per l'osservazione. Quindi, accendere il computer e il microscopio a forza atomica. Quindi selezionare la modalità di contatto, le sonde ContAI-G e le opzioni di pendenza automatica nel software.
Impostare i valori predefiniti per il controller Z impostando il set point a 20 nanometri, il guadagno P a 10.000, il guadagno I a 1.000, il guadagno D a zero e la tensione di punta a zero millivolt. Utilizzando la testa del range di scansione da 70 micrometri, posizionare i campioni in modalità di contatto AFM. Ottenere una rapida visualizzazione della superficie dell'area sotto la sonda utilizzando una telecamera montata su due obiettivi integrati nella testina di scansione.
Ora, scegli l'area desiderata spostandola manualmente nel piano XY. Lasciare che la sonda si avvicini elettronicamente alla superficie del campione fino al raggiungimento del contatto. Regolare elettronicamente il piano di misura XY dello scanner e la superficie del campione riducendo la direzione della pendenza XY.
Impostare i parametri standard del software su una riga al secondo e 256 punti per linea. Quindi eseguire un intervallo di scansione completo di un'area di 70 per 70 micrometri. Selezionare l'area più piccola utilizzando lo strumento zoom.
Selezionare una nuova area dal campione ritraendo elettronicamente il cantilever e spostando il campione lungo il piano XY. Quindi eseguire una nuova scansione come dimostrato in precedenza. Quindi, utilizzare il livellamento riga per riga nel menu degli strumenti dell'immagine nella selezione del filtro per eseguire l'elaborazione dei dati.
Ottimizza l'altezza massima e minima nella barra dei colori per ottenere la migliore risoluzione dell'immagine. Infine, eseguire l'analisi dell'immagine utilizzando il menu di analisi. Selezionare i punti iniziali e finali con lo strumento desiderato per determinare la lunghezza e la distanza.
L'analisi microscopica a forza atomica delle colture batteriche ha mostrato che le colture di Staphylococcus aureus erano distribuite da zone con aggregati di cocchi. L'aumento delle scale ha mostrato che c'era un maggiore apprezzamento della distribuzione della popolazione e della morfologia dei cocchi. Le immagini della modalità di contatto AFM hanno permesso la determinazione della dimensione dei cocchi che hanno mostrato una larghezza media di 1,25 micrometri.
Pseudomonas hunanensis ha mostrato una distribuzione omogenea su tutta la superficie di supporto del vetro formando un monostrato aderente. Le colture erano a forma di bastoncino con una lunghezza di 1,9 micrometri e una larghezza di 0,9 micrometri. L'esposizione alla microdiluizione delle nanoparticelle di ossido di magnesio di Staphylococcus aureus ha comportato la perdita di una superficie liscia e di contorni omogenei a causa del grave deterioramento della struttura cellulare.
La formazione di vescicole e il rilascio di materiale citosolico sono stati osservati in colture a concentrazioni più elevate rispetto al MIC. Risultati simili sono stati ottenuti nelle colture di E.coli con i controlli che mostrano superfici lisce che evidenziano la sua forma omogenea a bastoncello. La struttura è completamente scomparsa a 1.000 PPM di esposizione di nanoparticelle con solo sagome distinguibili.
È importante eseguire correttamente il fissaggio del campione in quanto è essenziale per ulteriori analisi. Il filtro immagine aiuta a fornire una buona risoluzione dell'immagine e dettagli del campione. Utilizzando il metodo di fissaggio, potrebbero essere applicate modalità senza contatto AFM che possono essere utili nello studio delle proprietà meccaniche.
Questa metodologia potrebbe essere uno strumento economico e utile per la ricerca medica e microbiologica incentrata sull'analisi del danno cellulare batterico.
