La crescita delle cellule vegetali è controllata dalle proprietà meccaniche delle loro pareti cellulari. Pertanto, è importante conoscere queste proprietà in diversi organi e tessuti delle piante. Il metodo qui presentato consente la caratterizzazione biomeccanica delle pareti cellulari non fisse e non disidratate nei tessuti interni delle giovani piante.
Iniziare con la preparazione delle soluzioni e del campione per il sezionamento della vibratomia. Versare uno strato di quattro millimetri di agarosio fuso al 3% sul fondo della piastra di Petri e lasciarlo raffreddare leggermente per evitare danni termici al campione. Posizionare orizzontalmente sull'agarosio lunghi circa cinque millimetri tre o quattro pezzi dell'organo vegetale.
Circa 30-60 secondi dopo, un sottile film semi-solido apparirà sopra il primo strato di agarosio. Quindi, versare con attenzione un secondo strato sopra. Dopo che l'agarosio è completamente solidificato, ritagliare il blocco contenente il campione.
Modella il blocco in una piramide tronca esagonale per garantirne la stabilità durante l'ulteriore sezionamento. Prima di iniziare il sezionamento del campione con il vibratomo, incollare il blocco allo stadio vibratomo con adesivo cianoacrilato. Posiziona il palco nel vibratomo, in modo che uno degli angoli della piramide sia rivolto verso la lama del vibratomo e versa acqua nel bagno di vibratomo.
Impostate i parametri di sezionamento come spessore della sezione, velocità della lama e frequenza di vibrazione e tagliate il campione. Utilizzando un pennello sottile, spostare la sezione dal bagno d'acqua su un vetrino e posizionare una goccia d'acqua sulla sezione per evitare che si secchi. Dopo aver controllato la qualità della sezione al microscopio ottico, selezionare la sezione appropriata con la parete cellulare perpendicolare al piano della sezione.
Quindi immobilizzare la sezione per le misurazioni al microscopio a forza atomica versando uno strato di un millilitro di agarosio fuso all'1% sul fondo del cappuccio della piastra di Petri usando una pipetta. Dopo che l'agarosio si è solidificato, rimuovere l'acqua in eccesso dalla sezione portando la carta da filtro sul bordo. Trasferire con attenzione la sezione dal vetrino al centro del cappuccio della piastra di Petri usando un pennello.
Quindi aggiungere con cautela l'1% di agarosio intorno alla sezione usando una pipetta da 20 microlitri e versare l'acqua o altra soluzione per la microscopia a forza atomica nel tappo della piastra di Petri con la sezione immobilizzata. Guidare il campione sotto il cantilever della microscopia a forza atomica usando il microscopio ottico. Fare clic sul pulsante Approach e quindi sul pulsante Landing per avvicinarsi al campione in modalità di contatto con un set point di un nanoampere.
Fare clic sul pulsante Scansione e quindi sul pulsante Area. Selezionare la dimensione dell'area di 50 micrometri per 50 micrometri da scansionare. Fare clic sul pulsante Sposta sonda e controllare l'intera area di scansione spostando lo scanner su di esso e trovando il punto più alto in base al grado di protrusione dello scanner.
Aprire la scheda Approccio. Quindi fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre dal campione. Utilizzando il punto più alto come destinazione, fare clic sul pulsante Landing per avvicinarsi nuovamente al campione.
Quindi controllare nuovamente la superficie facendo clic sul pulsante Sposta sonda e spostando lo scanner su di essa. Impostare la velocità di scansione su 0,5 hertz, quindi impostare la dimensione della scansione su 50 micrometri per 50 micrometri e il punto di scansione su 64 per 64. Fare clic sul pulsante Esegui e scansionare per verificare la superficie del campione ed è possibile contaminazione con agarosio.
Dopo aver fatto clic sul pulsante On, scegli la modalità HDPlus nel menu a discesa nella finestra principale del programma e imposta il set point su 0,1 nanoampere nella finestra principale del programma. Nella scheda principale della finestra HD, impostare i parametri di scansione appropriati per il campione studiato. Quindi apri la scheda Rumori nella finestra HD e inserisci la frequenza di risonanza del cantilever .
Apri la scheda Quant della finestra HD e inserisci IOS, rigidità a sbalzo, raggio della punta e angolo. Selezionare il modello di contatto, che verrà utilizzato per i calcoli in base alla geometria della punta. Successivamente, apri la scheda Scansione della finestra HD e seleziona i segnali, nonché la direzione in cui viene registrato il segnale.
Spuntare la casella Force Volume per ottenere una registrazione di tutte le curve di forza e fare clic sul pulsante Off nella parte superiore della finestra principale del programma per attivare il ciclo di feedback Fare clic sul pulsante Phase Core nella finestra HD principale per correggere la sensibilità del sistema ottico. La scheda Tempo Versus della finestra HD principale presenta la funzione del segnale DFL rispetto al tempo in tempo reale. Selezionare le parti di questa funzione che verranno utilizzate per la determinazione del livello di base e per adattare il modello di contatto per ulteriori calcoli.
Ora, imposta il valore del punto di scansione su 256 per 256 nella finestra principale del programma. Quindi, impostare la velocità di scansione su 0,2 hertz e fare clic sul pulsante Esegui per eseguire la scansione del campione. Dopo l'interruzione della scansione, fare clic sul pulsante On nella parte superiore della finestra principale per disattivare il ciclo di feedback.
Scegliere Modalità contatto nel menu a discesa, aprire la scheda Approccio e fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre dall'esempio. Fare clic sul pulsante Dati per aprire il software di analisi e salvare l'output. Aprire il file salvato nel software di analisi.
Selezionare il fotogramma del volume forza HD. Tenere premuto il tasto Ctrl e selezionare un fotogramma visivo ottenuto nella stessa direzione di scansione. Fare clic sul pulsante Carica mappa esterna per vedere dove si trovano le pareti cellulari.
Controllare i valori di rigidità InvOptSens e cantilever nella scheda principale. Apri la scheda Aggiuntivi e controlla i parametri della punta e il modello di contatto. Fate clic su vari punti delle pareti delle celle sulla cornice visiva e selezionate solo le curve ben descritte dal modello.
Le aree bianche nella mappa del modulo corrispondono a una sovrastima errata del modulo di Young dovuta al raggiungimento del limite da parte dello scanner nella direzione Z. Questa immagine non è comoda per essere utilizzata come mappa esterna per un'ulteriore selezione di curve di forza soddisfacenti. Tuttavia, la mappa del segnale DFL presentata a destra è più adatta qui.
Diversi strumenti possono riferirsi ai segnali DFL come segnali di deflessione o errore. Lo scanner che è stato completamente esteso durante il tentativo di raggiungere il fondo del campione può causare misurazioni errate e persino scansioni interrotte. La presenza di agarosio può essere controllata mentre si ottiene la prima scansione in modalità di contatto poiché le pareti cellulari e alcuni fondi cellulari sono visibili su tali scansioni.
Tuttavia, in caso di immobilizzazione imprecisa, la superficie può essere coperta di agarosio, che maschera la topografia del campione. Su quattro diverse curve di forza registrate in punti diversi della stessa parete cellulare, la curva registrata a 0,1 non mostra alcuna linea di base, il che significa nessuna separazione della punta a sbalzo dalla parete cellulare. La curva registrata a 0,3 mostra una spalla sulla parte in avvicinamento che indica la flessione della parete cellulare.
I punti due e quattro mostrano curve di forza soddisfacenti con valori di moduli simili. La preparazione e l'esame del campione richiedono pratica, ma possono essere padroneggiati. Una parte cruciale di questo protocollo è filtrare le curve risultanti.
Non fare affidamento sui moduli, che sono stati calcolati automaticamente. La stessa tecnica può essere utilizzata per misurare le forze di adesione o la dissipazione di energia. Può anche essere importante per la descrizione del comportamento viscosa o viscoelastico di alcuni materiali.
