Questo protocollo per il quale tutte le condizioni sperimentali sono state attentamente ottimizzate può essere utilizzato per facilitare una coniugazione chimica efficace ed efficiente dell'anticorpo DEC-205 all'antigene OAV. I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente una selezione flessibile dell'antigene proteico e dell'anticorpo e che non si basa sulla fusione genetica di questi componenti. Abbiamo anche utilizzato questo protocollo per generare coniugati di proteine del virus dell'epatite C e anti-DEC-205 per il targeting DC in vivo.
Questo potrebbe anche essere utile per gli approcci di vaccinazione antitumorale. Per avviare la produzione anti-DEC-205, risospese un volume di un millilitro da uno a cinque milioni di cellule NLDC 145 crioconservate scongelate in nove millilitri di 37 gradi Celsius ISF-1 mezzo integrato con 1% di penicillina e streptomicina, e seminare le cellule in un pallone di coltura cellulare di 25 centimetri quadrati per l'incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24-48 ore. Quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, trasferire l'intera sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.
Risospesso il pellet in 12 millilitri di mezzo ISF-1 isF-1 fresco completo a 37 gradi e ri-placcare le celle in un pallone da 75 centimetri quadrati. Dopo 48-72 ore di coltura, dividere la coltura confluente al 70% tra ciascuna delle due nuove fiasche da 75 centimetri quadrati e aggiungere sei millilitri di isF-1 medio fresco completo a ciascun pallone. Quando le colture raggiungono il 70% di confluenza, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per lavare i fondi e le superfici di coltura cellulare con la sospensione cellulare per raccogliere tutte le cellule e trasferire 10 millilitri di ogni sospensione espansa NLDC 145 celle in singoli flaconi a rulli PETG.
Quindi aggiungere 140 millilitri di mezzo ISF-1 completo a ciascuna coltura di bottiglie a rulli e coltivare le bottiglie a rulli a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 25 colpi al minuto per tre giorni. Per la purificazione degli anticorpi dal surnatante NLDC 145, posizionare l'estremità di un tubo di silicio nel becher riempito di surnatante e lasciare che 800 millilitri di surnatante scorrano a goccia attraverso una colonna di sefarosio della proteina G. Per l'eluizione, aggiungere 100 microlitri di 1,5 tris-HCL molari in ciascuno dei venti tubi da 1,5 millilitri e rimuovere il tappo di gomma dalla colonna.
Trasferire un millilitro di glicina molare 0,1 nella camera superiore della colonna e raccogliere l'anticorpo contenente eluente in uno dei tubi da 1,5 millilitri preparati e ripetere per ciascun tubo. Quando tutto l'anticorpo è stato raccolto e le eluizioni contenenti anticorpi sono state raggruppate, chiudere il fondo di un tubo di dialisi lungo 20 centimetri con un'appropriata chiusura del tubo di dialisi e pipettare con cura l'eluizione anticorpale nel tubo. Chiudere la parte superiore del tubo di dialisi con un secondo morsetto e fissare il morsetto superiore del tubo di dialisi a un supporto galleggiante.
Aggiungere una barra magnetica a un becher di PBS e posizionare il becher su un agitatore magnetico. Dopo la dialisi notturna a quattro gradi Celsius, aprire un morsetto per consentire il caricamento del dializzatore completo su un concentratore centrifugo con un taglio di peso molecolare di 10 kiloDalton e centrifugare il concentratore per 30 minuti a 693 volte G e quattro gradi Celsius. Alla fine dello spin, caricare il concentratore centrifugo con 10 millilitri di PBS per una seconda centrifugazione fino ad ottenere un volume finale da 1,5 millilitri di soluzione anticorpale.
Per coniugare l'OAV all'anticorpo anti-DEC-205, aggiungere 200 microlitri di PBS integrati con 500 microgrammi di proteina OAV, 240 microlitri di una soluzione TCEP-HCL appena preparata e 560 microlitri di acqua ultrapura sterile in un tubo da 1,5 millilitri per un'incubazione di 1,5 ore a temperatura ambiente. Allo stesso tempo, aggiungere 2,5 milligrammi di anti-DEC-205 in 900 microlitri di PBS e 100 microlitri di sulfo-SMCC appena preparato a un secondo tubo da 1,5 millilitri per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius a 550 giri al minuto in un blocco riscaldante. Alla fine delle incubazioni, posizionare le colonne di dissalazione con tappi allentati e fondi attorcigliati in singoli tubi conici da 15 millilitri e centrifugare le colonne per rimuovere il liquido.
Dopo la centrifugazione, posizionare le colonne in nuovi tubi con i tappi rimossi e caricare lentamente le soluzioni anticorpali sulfo-SMCC e OVA TCEP-HCL al centro del letto di resina compatto di una colonna per soluzione. Dopo la centrifugazione, scartare le colonne e mescolare immediatamente le soluzioni anticorpali e OAV con un pipettaggio delicato. Caricare la soluzione anti-DEC-205/OVA su un concentratore di proteine centrifughe e riempire il concentratore con PBS fino a un volume di 15 millilitri.
Centrifugare il concentratore per cinque minuti a 2.000 volte G e temperatura ambiente e riempire il concentratore con ulteriori 10 millilitri di PBS. Dopo aver centrifugato la concentrazione per almeno otto minuti nelle stesse condizioni di centrifuga, raccogliere delicatamente il campione concentrato dalla camera superiore. Per verificare il successo della coniugazione mediante analisi Western blot, caricare un'aliquota da ciascun campione su uno standard proteico su un gel SDS ed eseguire il gel secondo i protocolli di analisi SDS-PAGE standard.
Dopo il gel blotting, colorare le membrane con anticorpi coniugati con perossidasi di rafano per rilevare anti-DEC-205 o OVA secondo i protocolli standard. Le membrane possono quindi essere analizzate per la presenza della rispettiva proteina in ciascun campione. Per verificare il successo della coniugazione da parte di ELISA, rivestire un'appropriata piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 microlitri dell'anticorpo anti-OAV per pozzetto e diluire serialmente anti-DEC-205/OVA con un rapporto uno a due e tampone bloccante per ottenere diluizioni da sei microgrammi per millilitro a 93,8 nanogrammi per millilitro.
Aggiungere 100 microlitri di ogni diluizione ai pozzetti appropriati della piastra rivestita di anticorpi per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di anticorpo coniugato con perossidasi di rafano contro il coniugato anti-DEC-205/OVA alla piastra per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente, quindi aggiungere 50 microlitri di substrato di perossidasi di rafano a ciascun pozzetto per consentire l'analisi della reazione del colore mediante spettrofotometria. L'analisi parallela Western blot può essere utilizzata per rilevare sia l'OAV coniugato che l'anti-DEC-205 coniugato.
La colorazione per oAV consentirebbe la rilevazione di OAV liberi in eccesso se presenti, e la colorazione per anti-DEC-205 verifica il successo della coniugazione attraverso un aumento del peso molecolare tra l'anti-DEC-205 nudo e il coniugato. ELISA può anche essere utilizzato per valutare il successo della coniugazione con un'associazione positiva tra il segnale rilevato e la quantità analizzata di proteina che indica il successo della generazione di coniuge anti-DEC-205 / OAV. La citometria a flusso e l'analisi di immunofluorescenza mostrano chiaramente che il nucleo anti-DEC-205 lega in modo efficiente le cellule CD11c-positive derivate dal midollo osseo.
La vaccinazione con anti-DEC-205/OVA in combinazione con l'adiuvante induce un aumento dei titoli IgG specifici per oAV nei riceventi di topo rispetto alla vaccinazione con OAV e adiuvante da solo. Inoltre, l'anti-DEC-205/OVA induce in modo efficiente risposte sovraspecifiche delle cellule T CD4 e CD8-positive con le risposte delle cellule T CD8-positive indotte da anti-DEC-205/OVA significativamente superiori a quelle indotte dal solo OAV. Per una coniugazione di successo dell'antigene OAV all'anticorpo anti-DEC-205, è importante preparare i materiali come dimostrato ed eseguire le fasi di coniugazione in condizioni coerenti.
Dopo aver coniugato con successo l'antigene e l'anticorpo, sono possibili numerosi approcci successivi, tra cui l'analisi del legame e l'induzione dell'immunità patogena o correlata al tumore in vivo.
