I profagi sono fagi batterici, che si sono integrati nei genomi batterici. Stiamo utilizzando un approccio trascrittomico per esplorare in modo completo l'impatto dei profagi sulla biologia dei loro ospiti batterici. I metodi qui descritti affrontano la sfida chiave dell'induzione spontanea del ciclo litico profago.
Un'attenta ottimizzazione delle condizioni di coltura consente una profilazione pulita dell'espressione genica durante lo stato profago. I profagi si trovano nella maggior parte dei patogeni batterici, ma il significato di solito non è compreso. Questi strumenti possono illuminare il ruolo dei profagi come regolatori di molteplici funzioni batteriche.
Ci sono relazioni quasi illimitate con l'ospite del profago che rimangono non studiate. Ciò rappresenta un'enorme risorsa non sfruttata di potenziali bersagli terapeutici che questi protocolli possono aiutare a prevedere. La sfida principale è trovare la giusta condizione di coltura per bilanciare la crescita del lisogeno e l'induzione spontanea dei profagi.
La sfida secondaria ben nota, lyson, è il mantenimento dell'integrità dell'RNA per gli studi a valle. Per iniziare, preparare nuove colture di lisogeni e indicatori dell'ospite inoculando le colture notturne in 100 millilitri di LB in un rapporto di uno a 100. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 RPM.
Per monitorare la crescita del lisogeno, raccogliere un campione di un millilitro ogni ora dal punto di inoculazione per otto ore. In serie, diluire la coltura aggiungendo 100 microlitri in 900 microlitri del terreno LV. Vorticare alla massima velocità e continuare la serie di diluizione da 10 a meno uno a 10 a meno nove.
Versare 10 microlitri della diluizione richiesta su una piastra a coclea LB. Lasciare asciugare e incubare a 30 gradi Celsius per 18-24 ore. Dopo l'incubazione, contare il numero di colonie e calcolare il numero di cellule batteriche vitali utilizzando la formula data.
Successivamente, per enumerare le particelle fagiche infettive nel campione temporale, aggiungere 100 microlitri di cellule ospiti dell'indicatore resistente alla rifampicina in fase logaritmica alla coclea superiore fusa, insieme alla rifampicina. Individuare 10 microlitri di coltura lisogena diluita in serie sullo strato superiore della coclea inoculata. Lasciato asciugare e incubare a 37 gradi Celsius per 18-24 ore.
Dopo l'incubazione, contare il numero di placche e calcolare le particelle fagiche infettive utilizzando la formula fornita. Etichettare il primo matraccio come non indotto e gli altri come indotti, insieme ai punti temporali in cui ciascun campione deve essere raccolto. Quindi sottocoltura le colture lisogeniche cresciute durante la notte in 80 millilitri di LB con un rapporto di uno a 100 in otto fiasche da 250 millilitri.
Incubare i palloni a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 giri/min. Dopo 90 minuti, quando la densità ottica a 600 nanometri è compresa tra 0,1 e 0,2, aggiungere quattro microlitri di acido acetico glaciale all'1% nel pallone non indotto. Aggiungere la coltura da 80 millilitri dal pallone non indotto a 720 millilitri di LB e aggiungere immediatamente 160 millilitri di soluzione di arresto prima di posizionare il pallone su ghiaccio per 30 minuti per stabilizzare i trascritti dell'RNA.
Successivamente, aggiungere norfloxacina a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro al matraccio marcato indotto contenente 80 millilitri di coltura. Mescolare bene e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 RPM per un'ora. Lasciare che le cellule si riprendano aggiungendo 80 millilitri di coltura indotta a 720 millilitri di LB. Prelevare le cellule batteriche da ciascun pallone ogni 10 minuti da zero a un'ora aggiungendo una soluzione di arresto.
Centrifugare a 10.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Prima di risospendere delicatamente il pellet nel liquido residuo utilizzando la pipetta automatica regolabile. Trasferire la sospensione in una microprovetta da centrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 13.000 G per un minuto a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante residuo e sigillare il tubo del microfugo, prima di congelare i pellet in azoto liquido. Aggiungere un millilitro di Trizol a ciascun pellet congelato e omogeneizzare la sospensione mediante pipettaggio. Dopo aver identificato una serie di geni bersaglio che possono fungere da marcatori per ogni fase di replicazione del fago di interesse, amplificare ciascuno dei geni bersaglio dal DNA genomico utilizzando primer pertinenti.
Eseguire la PCR utilizzando le condizioni di amplificazione descritte nel manoscritto del testo. Dopo la PCR, utilizzando un kit di purificazione PCR, purificare ogni amplicone e clonarlo in un vettore di clonazione TA secondo le istruzioni del produttore. Verificare la sequenza di ciascun prodotto clonato mediante sequenziamento Sanger.
Dopo aver calcolato il numero di copie di quattro singoli plasmidi, preparare un modello standard per ciascun gene marcatore diluendo in serie il DNA plasmidico in acqua priva di nucleasi. Aggiungere un microlitro di CDNA e i rispettivi standard plasmidici per ciascun target in una piastra a 96 pozzetti. Ed eseguire la PCR quantitativa secondo le istruzioni del produttore.
Dopo la PCR, utilizzare il programma Excel per tracciare il numero di copie di DNA logaritmico rispetto alla soglia del ciclo. Eseguire un calcolo di regressione lineare per visualizzare il coefficiente di determinazione e un'equazione lineare. Successivamente, stimare il numero di copie per ogni destinazione utilizzando l'equazione lineare derivata dalla regressione lineare.
Quindi calcolare l'efficacia dell'amplificazione PCR utilizzando i parametri della regressione lineare della curva standard e l'equazione data. Dopo aver convalidato i primer in termini di efficienza percentuale, calcolare il numero assoluto di copie del DNA. L'enumerazione temporale della produzione spontanea di meno profagi ha suggerito i numeri più bassi di PFU per cellula a due ore e i numeri più alti di PFU per cellula a sei ore.
Il lisogeno era allora più stabile a due ore. Quindi questa condizione è stata utilizzata per la profilazione QRTPCR. È stato osservato un marcato aumento dell'espressione del gene cro, un marcatore precoce di replicazione litica da 2,31 volte 10 alla nona copia in colture non indotte a 3,02 volte 10 all'undicesima copia 30 minuti dopo l'induzione.
Allo stesso modo, anche le proteine P e O, il marcatore di fase intermedia della replicazione litica, hanno mostrato una significativa sovraregolazione da 1,74 volte 10 all'ottava a 1,25 volte 10 alla decima copia e da 6,05 volte 10 alla seconda a 5,68 volte 10 alla quinta copia. Il marcatore tardivo del ciclo di replicazione litica ha mostrato un notevole aumento dell'espressione nelle colture non indotte a 30 minuti dopo l'induzione. Tra i controlli interni testati, RPOD ha avuto l'espressione più stabile rispetto a 16 geni SRNA o ProC.
Rispetto ai marcatori per la replicazione litica, l'espressione del gene C-one era relativamente stabile. Tuttavia, il numero di copie del gene C-one era rassicurante nelle colture non indotte, rispetto ai marcatori per la replicazione litica. Nessun buon dato o interpretazione può provenire da una libreria di RNA mal preparata.
Il controllo dell'induzione spontanea e l'integrità dell'RNA sono le cose più importanti. La dinamica temporale di qualsiasi gene può essere studiata utilizzando il profilo di espressione. Adattare le giuste condizioni sperimentali e i giusti punti temporali è importante per mappare correttamente le risposte biologiche a qualsiasi stimolo.
Questa tecnica ha identificato interazioni precedentemente sconosciute tra due distinte partnership di ospiti dei profagi. Poiché la maggior parte dei batteri ospita profagi non studiati, questo approccio potrebbe aiutare a scoprire molti nuovi bersagli terapeutici o applicazioni.
