Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come la comprensione dei cambiamenti di espressione genica in migliaia di singole cellule dopo una lesione o una malattia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ci permette di sezionare trascrizioni di singole cellule all'interno di un tessuto complesso e di apprezzare meglio le dinamiche funzionali all'interno di una data popolazione. Il vantaggio del nostro protocollo è che fornisce metodi completi, dall'isolamento di singole cellule nei tessuti primari, all'analisi e alla visualizzazione di questo set di dati.
Sebbene questo metodo inizi da sospensioni uni-cellula dalla pelle e dal nervo, i metodi di sequenziamento che descriviamo possono essere applicati per studiare qualsiasi tessuto di mammiferi. A dimostrare questa procedura saranno Elodie Labit e Wisoo Shin, due tirocinanti del mio laboratorio. Per iniziare, sezionare il nervo sciatico di un topo eutanasiato tagliando prima la pelle dalla regione posteriore della parte posteriore del topo.
Utilizzare una lama di bisturi sterile per fare un'incisione lungo la lunghezza della coscia. Quindi utilizzare forcep e forbici fini per esporre e rimuovere il nervo sciatico. Per sezionare la pelle dorsale posteriore, usa forcette e forbici fini per fare incisioni da spalla a spalla, attraverso la groppa e lungo la schiena.
Lavare i tessuti due volte con HBSS ghiacciato. Al microscopio sezionato, rimuovere il tessuto connettivo indesiderato, i depositi di grasso o i detriti. Solo per la pelle, tagliare la pelle a fette sottili, usando una lama di bisturi sterile.
Per ottenere il derma cutaneo, galleggiare le fette della pelle in dispasi, in HBSS in un piatto di 10 centimetri, per 30-40 minuti a 37 gradi Celsius. Utilizzare le forcep fini per sbucciare e separare l'epidermide dal derma, quindi scartare l'epidermide. Quindi, per la pelle e il nervo, utilizzare un paio di lame di bisturi steril per tritare ogni campione in pezzi da uno a due millimetri.
Posizionare i pezzi di tessuto in un enzima collagenasi-quattro fredda appena scongelato, due grammi per millilitro in un tubo conico da 15 millilitri. Incubare ogni campione nell'enzima in un bagno Celsius di 37 gradi per 30 minuti con tremori delicati ogni 10 minuti. A 30 minuti, utilizzare un pipetter P1000 per triturare il tessuto da 20 a 30 volte e tornare al bagno d'acqua.
Ripetere la triturazione ogni 30 minuti fino a quando la soluzione appare torbide e pezzi di tessuto sono in gran parte dissociati. Solo per la pelle, nell'ultima ora di incubazione, aggiungere un milligrammi per millilitro DNAsi al campione di pelle. Poiché alcuni tipi di cellule sono più sensibili di altri allo stress meccanico, tecniche di dissociazione eccessive possono biasime la popolazione.
La dissociazione generale è fondamentale per ottenere elevate rese cellulari e una rappresentazione accurata della composizione tissutale. Successivamente, utilizzare un filtro da 40 micrometri sopra il tubo conico da 50 millilitri per filtrare due volte ogni campione di tessuto. Risciacquare il filtro con l'uno per cento di BSA/HBSS.
Dopo aver centrifugato i campioni come descritto nel manoscritto, sospendere di nuovo il pellet cellulare in HBSS, contenente l'uno per cento di BSA, utilizzando una punta a foro largo, e posizionare sul ghiaccio. L'aggiunta di colorante di vitalità ti aiuterà a ottimizzare la tua preparazione. Dovresti mirare ad almeno l'80% di cellule vitali.
Una volta ottimizzato, questo e altri passaggi di controllo qualità possono essere omessi al fine di accelerare il processo di dissociazione, che conserverà meglio la qualità dell'RNA e ridurrà la perdita cellulare. Per isolare le cellule vitali e sane utilizzando FACS, preparare prima tubi a fondo stretto da 15 millilitri con otto millilitri di BSA/HBSS per l'uno per cento ghiacciato per la raccolta dei campioni. Per garantire che l'interfaccia tra la superficie del liquido e l'interno del tubo sia umida e per prevenire la tensione statica e superficiale, invertire i tubi prima delle raccolte.
Immediatamente dopo lo smistamento delle celle FACS, una volta raccolte le cellule in un tubo da 15 millilitri, utilizzare un millilitro dell'uno per cento di BSA /HBSS per lavare e spingere tutte le cellule verso il basso dalla superficie laterale del tubo. Quindi centrifugare ogni campione a 260 g per otto minuti. Dopo aver scartato il supernatante, sospendere di nuovo il pellet cellulare in BSA/HBSS all'uno per cento e aggiungere 33,8 microlitri a un tubo e tenere quel tubo sul ghiaccio.
Questo passaggio è progettato per essere fatto utilizzando reagenti ottenuti da un kit standardizzato. Tutti i passaggi dimostrati devono essere eseguiti seguendo le istruzioni del produttore. Per prepararsi alla generazione GEM, posizionare un chip nel supporto del chip, preparare un mix di master di cellule sul ghiaccio, secondo il protocollo del produttore.
Aggiungere 56,2 microlitri del mix principale a un tubo contenente 33,8 microlitri di autososo sospensione. Per preparare il chip, prima al 50% di glicerolo ai pozzi che non verranno utilizzati. Quindi aggiungere 90 microlitri del mix di master di cellule a ben uno, 40 microlitri di perline di gel a ben due e 270 microlitri di olio divisorio a ben tre.
Coprire il chip con una guarnizione. Per caricare il chip ed eseguire in un controller a cella singola, espellere prima il vassoio. Metti il truciolo nel vassoio.
Ritrarre il vassoio e premere play. Dopo l'esecuzione completa, raccogliere 100 microlitri del campione e posizionarli in un tubo PCR. Posizionare i tubi PCR in una macchina PCR preimpostata e funzionare in base al kit.
Dopo la corsa, i GEM includeranno cDNA con codice a barre a lunghezza intera, da mRNA poliadenilato. Posizionare i tubi a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Procedere con la costruzione, il sequenziamento, l'allineamento e l'analisi della libreria.
Una volta che i campioni sono sequenziati e allineati come descritto nel manoscritto, depositare i dati su un repository pubblico, come il GEO di NCBI. Per fare ciò, registrati per l'account di invio. Per prima cosa, completa l'invio GEO scaricando il foglio dei metadati.
Assicurarsi di includere un solo foglio di metadati per invio del progetto. Inserire il foglio di calcolo nella directory. In secondo luogo, aggiungere il file di dati non elaborati generato dallo script di conteggio dei ranger di celle per tutte le librerie nella directory.
La terza cartella è file di dati elaborati. Inserire nella directory i file di dati elaborati generati dallo script del conteggio dei ranger di celle per tutte le librerie. Utilizzare le credenziali del server FTP dell'inviatoRE GEO per trasferire la directory contenente tutti e tre i componenti.
Dopo aver eseguono Cell Ranger, le matrici di codici a barre geniche pronte per l'analisi possono essere ulteriormente elaborate utilizzando bioinformatica avanzata. In primo luogo, i controlli della quantità pre-elaborazione sono stati effettuati utilizzando il pacchetto Seurat R, che ha generato trame di violino e dispersione per visualizzare il numero di geni, il numero di identificatori molecolari univoci e la percentuale di geni mitocondriali per identificare doppietti cellulari e valori anomali. Per la selezione dei componenti principali, o PC, sono stati utilizzati grafici a gomito, in cui sono stati esclusi PC oltre l'altopiano della deviazione standard dell'asse del PC.
Anche la risoluzione del clustering è stata manipolata. La bassa risoluzione ha portato a un minor numero di cluster di celle, con ogni cluster che probabilmente rappresenta un tipo di cella definito. L'alta risoluzione portò ad una maggiore probabilità cellulare, che rappresentava sottotipi, o stati di transizione, di una popolazione cellulare.
Le impostazioni dei cluster a bassa risoluzione sono state utilizzate per ulteriori analisi delle mappe di calore di espressione per identificare i geni più espressi in un dato cluster. I singoli geni candidati sono stati visualizzati su appezzamenti tSNE, usando la funzione feature plot di Seurat, che ha permesso la decifrazione, se ci fossero ammassi che rappresentavano, ad esempio, macrofagi. Sia il cluster due che quattro espressero CD68, un marcatore pan-macrofago.
Altri pacchetti forniscono anche strumenti per il controllo di qualità, ad esempio Monocle, un pacchetto R utilizzato per costruire traiettorie cellulari, rimuove le celle di scarsa qualità e garantisce che la distribuzione dell'mRNA tra tutte le celle sia normale al log e cada tra i limiti superiore e inferiore. Le singole cellule sono state quindi classificate e contate, utilizzando geni marcatori di lignaggio noti, e le cellule che esprimono marcatori di interesse sono state assegnate al tipo di cellula numero uno. È stato determinato che il tipo di cellula numero uno erano i fibroblasti.
Questa popolazione è stata valutata per costruire la traiettoria di sviluppo dei fibroblasti. Seguendo questa procedura, altri metodi come la PCR quantitativa, l'ibridazione in situ, una chimica immunista devono essere eseguiti per convalidare l'accuratezza dei risultati dell'espressione genica. Il sequenziamento dell'mRNA a cellule singole ha ora spianato la strada ai ricercatori in molti campi diversi per esplorare l'eterogeneità cellula-cellula e identificare la dinamica funzionale all'interno di diversi tessuti durante l'omeostasi, e come questi possono cambiare dopo la lesione o nello sviluppo della malattia.
