Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (GM070736) a H. Fölsch. SF Ang è stato sostenuto da una borsa di studio * Un premio STAR Graduate, e RS Kang è stata sostenuta dalla basi cellulari e molecolari della malattia programma di formazione (GM8061)

1. Isolamento del DNA plasmidi <ol><li> Utilizzare un Sigma-Aldrich privo di endotossine maxiprep kit per la preparazione del DNA libero endotossina secondo il protocollo del produttore. Questo kit funziona per noi, perché rimuove in modo efficace qualsiasi endotossine da preparazioni di DNA. Endotossine che vengono iniettati con il DNA nei nuclei delle cellule porterà alla morte cellulare. </li><li> Aggiungere 100 ul fenolo / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) al DNA isolato, vortice e gira per 1 minuto a 13.000 giri al minuto in una microcentrifuga Eppendorf. Trasferire la fase superiore acqua in un nuovo tubo e aggiungere 100 ul cloroformio / isoamylalcohol (24:1), vortice e spin come sopra. Trasferire la fase superiore acqua contenente il DNA in una nuova provetta. Questo passaggio è necessario per rimuovere qualsiasi proteina dal DNA, che impedisce l&#39;intasamento dell&#39;ago microiniezione. </li><li> Precipitare il DNA con l&#39;aggiunta di acetato di sodio (pH 6.0) ad una concentrazione finale di 300 mm e 2 X etanolo 100% vol. Incubare a -20 ° C durante la notte. Spin DNA per 20 minuti a 13.000 rpm in una microcentrifuga Eppendorf, lavare una volta con etanolo al 70%, e risospendere in 300 ml d&#39;acqua privo di endotossine (Sigma-Aldrich). </li><li> Determinare la concentrazione di DNA. Una concentrazione di DNA tipico varia da 1 a 5 mcg / mL. </li></ol> 2. Coltura di cellule MDCK <ol><li> Dividere le celle MDCK. Contare le celle e semi di 4 x 10 5 cellule chiare sul 12-mm filtri Transwell (0,4 micron dimensione dei pori, Corning Costar, 3460). Per un esperimento di controllo che contiene un mock-iniezione e di due diverse proteine ​​Rab mutante è necessario seme tre filtri. </li><li> Cellule in coltura MDCK medio MEM con 2 mM L-glutammina, 0,1 mg / ml di penicillina / streptomicina e il 7% (v / v) siero fetale bovino (= supporto della crescita MEM) a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Modifica dei media nella camera di basolaterale ogni giorno. Questo aiuta il processo di polarizzazione, perché imita la situazione delle cellule epiteliali negli animali. </li><li> 2 giorni dopo la semina il check-in un microscopio se le cellule sono in crescita in un monostrato chiuso. Se non è possibile rilevare eventuali buchi nella monostrato, eseguire l&#39;esperimento il giorno 3. Se ci sono ancora buchi, eseguire l&#39;esperimento il giorno 4. </li></ol> 3. Microiniezione Procedura e post-iniezione incubazioni <ol><li> Il giorno dell&#39;esperimento preparare 5 ml terreni di coltura MEM più 50 HEPES mM in una piastra 60 x 15 mm per ogni filtro e posto in un incubatore a 39 ° C. Inoltre, impostare un bene di un 12-pozzetti con 1 ml di terreno di coltura MEM più 50 HEPES mM e 0,1 mg / ml cicloesimide per filtro, e posto in un incubatore 31 ° C. </li><li> Accendere il microscopio microiniezione e impostare il suo stadio riscaldato a 39 ° C. Usiamo un microscopio invertito (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) con una fase di riscaldamento, gli obiettivi 10X e 32X e un FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Infine, aprire il serbatoio di azoto che fornisce il tavolo aria con azoto. </li><li> Diluire il DNA con acqua filtrata (l&#39;uso del filtro 0,2 micron) ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml in un volume totale di 10 - 100 l. Successivamente, rotazione del DNA in microcentrifuga Eppendorf a 13.000 rpm per 30 min. Rimuovere parte superiore e mettere in un nuovo tubo. Questa fase assicura che quando si carica il vostro DNA diluito in microiniezione l&#39;ago si può caricare con precisione il DNA &quot;pulita&quot;. Il vostro DNA è ora pronto per microiniezione. </li><li> Preparate le vostre cellule estrapolando il primo filtro della sua capsula di Petri. Con una lama chirurgica (Blade Feather chirurgico, acciaio inox, n. 11), tagliare il filtro dal porta filtro e il luogo in 5 ml, 39 ° C caldo terreni di coltura MEM HEPES più 50 mm (60 x 15 mm Piastra). Appesantire il filtro nella piastra di coltura con la lama chirurgica utilizzata per tagliare fuori. Posizionarlo sul filtro tale che il foro della lama chirurgica circonda il centro del filtro. Inserisci la tua piastra di coltura sul palco riscaldato del microscopio. </li><li> 2-3 ml di carico vostro DNA diluito (in questo caso la codifica plasmidi VSVGts045-GFP controllo iniezione = finta) in un ago da microiniezione (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), ruotare il coperchio di protezione dell&#39;ago e lasciarlo cadere a terra . Ora l&#39;ago è pronto per essere avvitato nel relativo supporto. Per farlo, premere il tasto menu del vostro InjectMan e assicurarsi che la valvola è chiusa. Avvitare l&#39;ago nel relativo supporto, fai attenzione a non avvitare l&#39;ago troppo stretto come che possono portare alla rottura. Ora, premere il tasto Menu di nuovo, il applicata P c impedisce ai media di essere risucchiati l&#39;ago durante la procedura microinjeciton. Infine, toccare il joystick per cancellare homing memorizzati. </li><li> Per abbassare l&#39;ago sulla cellule, utilizzare l&#39;obiettivo 10X e portare l&#39;ago nel fascio di luce al di sopra del liquido. Ora concentrarsi sulle cellule, portare l&#39;attenzione di nuovo girando la ruota di fuoco a 180 °, e trovare l&#39;ago. In seguito, lentamente spostare l&#39;ago a fuoco, quindi portare fuori fuoco ancora una volta (lavorando per portare le cellule a fuoco ancora una volta), far scendere l&#39;ago in percus di nuovo. Ripetere fino a quando l&#39;ago tocca la superficie del supporto, a quel punto tutto quello che vedrete è un alone. Quando si raggiunge un punto in cui le cellule sono a fuoco, ma l&#39;ago è ancora sfocata (cioè fuori dal piano focale) modifica l&#39;obiettivo 32X e fine impostazioni grossolana. </li><li> Impostare il z-limite toccando la membrana apicale con la punta dell&#39;ago e sottraendo circa 10 micron, come i nuclei che sono circa 10 micron al di sotto della membrana apicale. </li><li> Dopo aver impostato la z-limite, la giusta pressione di iniezione. Inizio a 95 PSI. Se la pressione è troppo alta, le cellule farà saltare in aria. Se la pressione è troppo bassa, si vedrà un puntino bianco che rimane, ma non succede nient&#39;altro. Con una iniezione di successo, si vedrà un cambiamento di fase, senza un cambiamento di dimensione delle celle. Per l&#39;iniezione, portare l&#39;ago di un paio di micron fuori del piano focale il più velocemente possibile. Puntare con l&#39;ago al di sopra del nucleo (ovvero la metà di una singola cella) e premere il pulsante di iniezione del joystick, ma non tenere premuto il pulsante. </li><li> Iniettare 100-500 cellule all&#39;interno del foro della vostra lama chirurgica che giace sulle vostre cellule. Quando hai finito, inserire il vostro cellule con il piatto la cultura e la lama chirurgica in un incubatore 39 ° C, e incubare per 2 ore Durante questo periodo, VSVGts045-GFP è espressa e secreta nel ER. Tuttavia, a 39 ° C, VSVGts045-GFP non può piegare correttamente e quindi non può lasciare il Pronto Soccorso. Nel frattempo, la piccola GTPasi di interesse si accumula nel citosol in co-iniezione esperimenti. </li><li> Dopo 2 h, posto le cellule in 1 ml di terreno di coltura MEM più 50 HEPES mM e 0,1 mg / ml cicloeximide in un 12-pozzetti ed incubare per 2 ore a 31 ° C. Durante questo periodo di caccia, VSVGts045-GFP si piega correttamente, lasciare il pronto soccorso e viene consegnato alla superficie cellulare. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,10 per filtri due (iniettare plasmidi codifica VSVGts045-GFP e, per esempio V5-tagged Rab13T22N) e tre (iniettare plasmidi codifica VSVGts045-GFP e, per esempio V5-tagged Rab13Q67L). Ogni iniezione di circa 20 - 60 min. Tuttavia, è assolutamente cruciale per il trattamento di ogni filtro stesso modo in tutta incubazioni spostare la temperatura e la colorazione della superficie fino a fissare le cellule. Dopo la fissazione, è possibile eseguire il resto della tua protocollo di colorazione per tutti i filtri al tempo stesso. </li></ol> 4. La colorazione della superficie per l&#39;analisi di immunofluorescenza Nota, in modo da evitare lo sbiancamento del segnale della GFP VSVGts045-GFP, proteggere i campioni dalla luce coprendo con un foglio di alluminio durante tutte le procedure successive. <ol><li> Se si desidera procedere alla colorazione della superficie, luogo vostre cellule in una capsula di cultura su una lastra di metallo su ghiaccio e lavarsi le cellule 1X PBS freddo con ghiaccio 2 + (PBS [0,2 g / litro di KCl, 0,2 g / litro KH 2 PO 4, 8 g / litro di NaCl e 2,17 g / litro Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] oltre 0,1 g / litro CaCl 2 e 0,1 g / litro MgCl 2 x 6 H 2 O). Successivamente, versare 30 ml di un anticorpo che riconosce la ectodomain della vostra proteina, in questo caso il mouse TK1 anticorpo monoclonale (IgG 1, ottenuto dalla fine Thomas Kreis), su parafilm pulito posizionato sulla piastra di metallo sul ghiaccio. Posizionare il filtro con le vostre cellule a testa in giù sul menu e aggiungere alcune gocce di anticorpi sul retro del filtro. Incubare per 1 h sul ghiaccio. </li><li> Cellule posto in un 12-pozzetti, lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio 2 + (o RT caldo PBS 2 + senza colorazione superficie prima), e fissare con il 3% paraformaldeide per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule una volta con PBS 2 + e lasciare in PBS 2 + per 5 min. </li><li> Incubare cellule nel bloccare / buffer permeabilizzazione (BPB) (2% [peso / volume] BSA, 0,4% [peso / volume] saponina in PBS 2 +) con il 10% [vol / vol] siero di capra. Incubare 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Diluire gli anticorpi primari per rilevare l&#39;espresso Rab GTPasi, in questo esempio anti-V5 (topo monoclonale IgG 2a, Invitrogen), 1:200 in BPB. Spin anticorpi diluita in una microcentrifuga Eppendorf per 10 minuti a 13.000 giri al minuto. Versare 30 ml di soluzione di anticorpi su parafilm pulita posto in una camera umida. Posizionare le celle filtro a testa in giù sul calo degli anticorpi e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Cellule posto posteriore (fino a destra) in un 12-pozzetti e lavare 5 volte oltre 30 minuti con BPB a temperatura ambiente. </li><li> Diluire appropriati anticorpi secondari, in questo caso di capra anti-topo IgG 1 Alexa 594-etichetta (per VSVG rilevamento in superficie, Invitrogen) e Cy5-etichettati anticorpi secondari di riconoscere il vostro GTPasi Rab, in questo esempio di capra anti-topo IgG 2a Cy5 marcato (ImmunoResearch Jackson), 1:200 in BPB e spin come sopra. Si introducono 30 microlitri soluzione di anticorpi su parafilm pulita in una camera umida e cellule luogo il filtro a testa in giù sul calo degli anticorpi. Incubare 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere il punto 4.6. </li><li> Dip cellule su filtro 3X in acqua deionizzata e luogo rverso l&#39;alto ight su microslides. Aggiungere 10-15 microlitri di montaggio (10% [peso / volume] DABCO, 50% [peso / volume] glicerolo in acqua distillata) sulla parte superiore delle celle. Luogo 18x18 millimetri di vetro di copertura micro sulla parte superiore e utilizzando tessuti facciali premere delicatamente il coperchio sul bicchiere micro cellule. Sigillare con smalto. </li><li> Analizzare i campioni con un microscopio confocale. Abbiamo usato un Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc. che era dotata di un obiettivo 63x immersione in acqua. </li><li> Per la preparazione di figure, regolare e combinare immagini utilizzando programmi come Adobe Photoshop e Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Per esempi su come la co-espressione di piccole GTPasi interferisce con VSVG ordinamento gentilmente si riferiscono ad articoli pubblicati sia per missorting apicale 3, 4 o inibizione di consegna superficie 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Nel finto-iniezione, cioè una iniezione di solo il plasmide codifica VSVGts045-GFP, la proteina viene consegnato alla superficie basolaterale delle cellule MDCK ben polarizzato come giudicato dalla colorazione della superficie (in rosso, figura 1 A). Si noti che non tutti i VSVGts045-GFP viene consegnato alla membrana basolaterale durante la caccia a 31 ° C, come evidenziato dal segnale intracellulare ampio per la proteina totale (in verde, figure 1 A e B). Nelle cellule che non sono ben polarizzato VSVGts045-GFP sarà consegnato anche alla membrana apicale (Figura 1 B). Se il vostro campioni di controllo simile alla cellula nella Figura 1 B, non ti puoi fidare dei dati e necessario ripetere l&#39;esperimento con più polarizzato cellule. Barre di scala sono 5 micron.

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le fasi più critiche per un esperimento di microiniezione di successo sono la qualità e la purezza del DNA e la polarità delle cellule. Senza cellule polarizzate, il controllo iniezione sarà già mistargeted VSVG e l&#39;esperimento non può essere utilizzato. Se il DNA è di scarsa qualità, il DNA può intasare l&#39;ago dell&#39;iniezione porta a scarsa o assente espressione della proteina desiderata a tutti. Inoltre, è consigliabile utilizzare i plasmidi di espressione che sono conosciuti per portare a livelli ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscopio con stadio riscaldato </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Ordine personalizzato </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet micromanipolatore </td><td> Eppendorf </td><td> Ordine personalizzato </td></tr><tr><td> Femtotips II (aghi Microiniezione) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader suggerimenti </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Chiara da 12 mm transwell filtro supporta </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotossina-free kit maxiprep plasmide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Le cellule epiteliali polarizzare la loro membrana plasmatica in domini apicale e basolaterale biochimicamente e funzionalmente distinti in cui il dominio apicale si affaccia sul &#39;libero&#39; delle superfici e la membrana basolaterale è in contatto con il substrato e le cellule vicine. Entrambi i domini di membrana sono separati da giunzioni strette, che formano una barriera alla diffusione. Apicale-basolaterale polarizzazione può essere riassunta con successo in coltura quando le cellule epiteliali, come Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sono teste di serie ad alta densità su filtri in policarbonato e coltivate per diversi giorni 1 2. Creazione e mantenimento di polarità delle cellule è regolata da una serie di piccole GTPasi della superfamiglia Ras come Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 e Rab13 3 4 5 6 7. Come tutte le GTPasi queste proteine ​​ciclo tra un inattivo PIL legato Stato e un attivo GTP-bound stato. Specifiche mutazioni nelle regioni nucleotide binding interferire con questo ciclismo 8. Per esempio, Rab13T22N è permanentemente bloccato nella forma del PIL e quindi soprannominato &#39;dominante negativo&#39;, mentre Rab13Q67L non può più idrolizzare GTP e quindi è bloccata in uno stato &#39;dominante attivo&#39; 7. Per analizzare la loro funzione nelle cellule entrambi gli alleli dominanti negativi e dominante attiva della GTPasi sono tipicamente espressa ad alti livelli di interferire con la funzione delle proteine ​​endogene 9. Un modo elegante per raggiungere elevati livelli di overespressione in un breve lasso di tempo è quello di introdurre i plasmidi codifica le proteine ​​pertinenti direttamente nei nuclei delle cellule coltivate su filtro polarizzato supporta l&#39;utilizzo di tecnica microiniezione. Questo è spesso combinata con la co-iniezione di plasmidi reporter che codificano recettori di membrana plasmatica che sono specificamente ordinati al dominio apicale o basolaterale. Un carico di frequente utilizzato per analizzare carico ordinamento al dominio basolaterale è un allele sensibile alla temperatura del virus della stomatite vescicolare glicoproteina (VSVGts045) 10. Questa proteina non può piegare correttamente a 39 ° C e sarà quindi mantenuto nel reticolo endoplasmatico (ER), mentre la proteina regolatrice di interesse è assemblata nel citosol. Uno spostamento a 31 ° C, quindi consentire VSVGts045 piegare correttamente, lasciare il Pronto Soccorso e viaggiare alla membrana plasmatica 11. Questa caccia viene di solito effettuata in presenza di cicloesimide per evitare ulteriori sintesi proteica che porta a ottenere risultati più nitidi. Qui si descrivono in dettaglio la procedura di microinjecting plasmidi in cellule polarizzate e successive incubazioni compresi turni di temperatura che permettono una analisi completa delle proteine ​​regolatrici coinvolte nella selezione basolaterale.

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Questo articolo precisa le procedure necessarie per l&#39;iperespressione e l&#39;analisi delle piccole GTPasi in cellule epiteliali polarizzate usando la tecnica microiniezione.

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

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Biology

11.3K Views.  Northwestern University. Questo articolo precisa le procedure necessarie per l'iperespressione e l'analisi delle piccole GTPasi in cellule epiteliali polarizzate usando la tecnica microiniezione.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Ricerca

Biologia

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l&#39;Air Interface Liquid

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

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