Questo protocollo consente di manipolare proteine, o espressione di microRNA, in adipociti differenziati per studiare il loro ruolo nella funzione degli adipociti. Questo metodo di trasfezione inversa è un metodo semplice, economico e altamente efficiente per trasfettare oligonucleotidi in adipociti 3T3-L1 di topo. Questo metodo può essere applicato anche ai preadipociti umani differenziati in adipociti.
A dimostrare la procedura sarà Melanie Gaudfrin, un tecnico del nostro laboratorio. Coltiva i fibroblasti 3T3-L1 in piatti da 100 millimetri in DMEM senza piruvato, glucosio 25 millimolare, siero di vitello appena nato al 10% e penicillina e streptomicina all'uno percento. Posizionare i piatti in un incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius e al sette percento di anidride carbonica.
Due giorni dopo la confluenza, cambiare il terreno di coltura, sostituendolo con DMEM senza piruvato, 25 millimolare di glucosio, 10% FCS e l'uno per cento di penicillina e streptomicina integrati con 0,25 millimolari IBMX, 0,25 desametasone micromolare, cinque microgrammi per millilitro di insulina e 10 rosiglitazone micromolare. Incubare i piatti per due giorni. Due giorni dopo, sostituire il terreno di coltura con DMEM senza piruvato, 25 millimolari di glucosio, 10% FCS e l'uno per cento di penicillina e streptomicina integrati con cinque microgrammi per millilitro di insulina e 10 rosiglitazone micromolare e incubare per altri due giorni.
Nutrire le cellule ogni due giorni con DMEM senza piruvato, glucosio 25 millimolare, 10% FCS e l'uno per cento di penicillina e streptomicina e mantenere le cellule nell'incubatrice. Un giorno o poche ore prima della trasfezione, preparare una soluzione di collagene di tipo I a 100 microgrammi per millilitro in etanolo al 30% da una soluzione stock a un milligrammo per millilitro. Aggiungere 250 microlitri di collagene per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti o 125 microlitri per pozzetti per pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e distribuire la soluzione sulla superficie del pozzo.
Lasciare il piatto senza il coperchio sotto il cappuccio della coltura fino a quando il collagene si asciuga. Quindi lavarlo due volte con D-PBS. Pipettare il siRNA con un mezzo essenziale minimo migliorato per miscelare e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere il reagente di trasfezione e il mezzo essenziale minimo migliorato al siRNA e alla pipetta per mescolare. Incubarlo per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzo della piastra rivestita di collagene.
Lavare le cellule nella capsula di Petri da 100 millimetri due volte con D-PBS. Aggiungere 5x tripsina alle cellule, assicurandosi di coprire l'intera superficie con la tripsina. Attendere 30 secondi e rimuovere con attenzione la tripsina.
Incubare la capsula di Petri per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatrice. Quindi toccare il piatto per staccare le cellule, evitando danni alle cellule. Aggiungere 10 millilitri di DMEM senza piruvato, 25 millimolari di glucosio, 10% FCS e l'uno per cento di penicillina e streptomicina per neutralizzare la tripsina.
Pipettare con cura il mezzo su e giù per staccare le cellule e omogeneizzare la sospensione cellulare. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Malassez o un contatore di celle automatizzato e regolare la concentrazione delle cellule a 0,625 milioni di cellule per millilitro di mezzo. Seminare 800 microlitri della sospensione cellulare per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti o 400 microlitri della sospensione cellulare per pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente la miscela di trasfezione.
Incubare le piastre in un incubatore di colture cellulari e non disturbarle per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire con cura il surnatante con DMEM fresco senza piruvato, glucosio 25 millimolare, 10% FCS e penicillina e streptomicina all'uno per cento e restituire le cellule all'incubatrice. I punti temporali tipici per rilevare l'abbattimento del bersaglio dopo la consegna di siRNA o miR sono da 24 a 48 ore per l'mRNA e da 48 a 96 ore per le proteine.
Esperimenti funzionali possono essere eseguiti su adipociti trasfetti tra cui la segnalazione di insulina, l'assorbimento di glucosio, la secrezione di adipochine, la lipolisi e la lipogenesi. Gli adipociti hanno dimostrato di preservare la loro morfologia dopo la trasfezione. Due giorni dopo la trasfezione, gli adipociti hanno presentato goccioline lipidiche multiloculari con contenuto lipidico non diverso tra gli adipociti trasfettate e non trasfettate.
L'espressione dell'mRNA di vari marcatori di differenziazione è rimasta invariata nelle cellule trasfettate rispetto a quella degli adipociti non trasfettate. Il protocollo di trasfezione inversa è efficiente in quanto oltre il 70% degli adipociti sono stati trasfettate. Tre giorni dopo la trasfezione con siRNA contro Perilipin-1, il livello di mRNA di Perilipin-1 era diminuito del 70% e il livello proteico del 63% L'espressione di Perilipin-1 è stata analizzata anche al microscopio a fluorescenza quattro giorni dopo la trasfezione ed è risultato essere diminuita del 92% rispetto alla sua espressione negli adipociti di controllo.
La trasfezione inversa di adipociti con microRNA che imita oligonucleotidi per up-regolare l'espressione di miR-34a è mostrata qui. La sovraespressione di miR-34a ha portato alla diminuzione dell'espressione della proteina VAMP2 del 50%L'abbattimento della perilipina-1 negli adipociti 3T3-L1 ha portato ad un aumento della lipolisi basale mentre la sovraespressione di miR-34a ha portato all'inibizione della fosforilazione della proteina chinasi B indotta dall'insulina e all'assorbimento del glucosio. È importante raggiungere un alto livello di differenziazione degli adipociti per eseguire la trasfezione su adipociti di nuova differenziazione e monitorare attentamente il trattamento degli adipociti con tripsina.
Dopo la trasfezione, è possibile eseguire esperimenti funzionali sugli adipociti per studiare l'impatto della manipolazione di proteine o microRNA sulla segnalazione dell'insulina, sull'assorbimento del glucosio, sulla lipogenesi e sulla lipolisi.
