Questo protocollo descrive come eseguire lo screening dei batteri con impatto sulla resistenza allo stress termico ossidativo di C.elegans in due ceppi di C.elegans su 48 isolati batterici in parallelo. Questo approccio è versatile e scalabile. Permette uno screening rapido di molteplici condizioni con impatto su C.elegans contro la salute, che è applicabile allo studio dei meccanismi di salute e malattie.
Utilizzando la resistenza allo stress come proxy per la salute, questa pipeline è facilmente applicabile allo screening preclinico di farmaci, antiemetici e probiotici su modelli di mutanti nematodi, knockdown, transgenici e di malattia. La capacità di testare molte condizioni in parallelo consente lo studio di interazioni complesse coinvolte e serve processi fisiologici. Questi includono interazioni microbiche dell'ospite, disturbi metabolici, gestione dello stress e invecchiamento.
È fondamentale evitare la contaminazione in tutto. Non permettere ai vermi di rimanere senza cibo ed eseguire i passaggi chiave non appena i vermi raggiungono lo stadio richiesto. Inizia con la preparazione di una coltura concentrata di batteri E.coli OP50 inoculando quattro bottiglie da un litro di brodo lisogeno con due millilitri di coltura iniziale OP50 ciascuna.
Quindi posizionare le bottiglie in un'incubatrice agitante per sei ore a 37 gradi Celsius e 160 G, quindi pellettare i batteri a 3057 G e 20 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere il pellet con sei millilitri di terreno OP50. Raccogliere la coltura concentrata in un tubo conico sterile da 50 millilitri.
Inoculare otto piastre NGM da sei centimetri per ceppo con 100 microlitri di coltura OP50 satura coltivata durante la notte a 37 gradi Celsius per piastra. Quindi tenere le piastre a 20 gradi Celsius per due giorni prima dell'uso. Quindi tagliare un pezzo quadrato di agar di 0,5 centimetri con vermi da una piastra NGM recentemente affamata usando un bisturi e trasferirlo su ciascuna delle otto piastre NGM inoculate da sei centimetri.
Incubare queste piastre a 20 gradi Celsius per tre giorni. Quindi, risospendere i vermi aggiungendo fino a tre millilitri di tampone sterile M nove alle piastre NGM da sei centimetri utilizzando una pipetta P1000 e raccogliere la soluzione di vite senza fine da tutte le otto piastre per ceppo in un singolo tubo conico da 15 millilitri. Quindi centrifugare a 142 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con cura il surnatante utilizzando una pipetta P5000 o una pompa dell'acqua dotata di una pipetta o punta sterile Pasteur.
Successivamente, aggiungere 10 millilitri di tampone sterile M nove per lavare il pellet di verme. Quindi, rimuovere il surnatante e trasferire i vermi su una piastra NGM inoculata OP50 da 15 centimetri integrata con OP50 concentrato utilizzando una pipetta. Coltiva ogni ceppo di verme su una piastra NGM di 15 centimetri di diametro per tre o quattro giorni a 15 gradi Celsius rialimentando i vermi con 0,5 millilitri di OP50 concentrato al giorno.
Dopo aver raccolto e lavato un tampone M nine, trasferire ogni coltura di ceppo di vermi in più piastre NGM e propagare i vermi a 20 gradi Celsius fino a quando il 95% della popolazione è costituita da adulti gravidi. Quindi sbiancare i vermi adulti gravidi seguendo il metodo standard di preparazione delle uova e trasferire le uova su due piastre NGM da 15 centimetri non seminate per 24 ore a 15 gradi Celsius per consentire a tutte le larve di L uno di schiudersi e crescere in modo sincrono nei passaggi successivi. In primo luogo, raccogliere tutta la massa batterica precedentemente coltivata su una piastra di agar LB di sei centimetri e trasferirla in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettato contenente un millilitro di tampone M nine.
Quindi vortice il tubo della microcentrifuga fino a quando i pellet batterici sono completamente risospesi. Quindi, girare a 9, 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere 700 microlitri di surnatante. Ancora una volta ri-sospendere il pellet batterico per vortice.
Successivamente, trasferire 200 microlitri di ciascuna sospensione batterica in un singolo pozzetto di una piastra sterile vuota da 96 pozzetti. Da questa piastra, inoculare otto piastre di agarosio NGM da 96 pozzetti con 10 microlitri di soluzione batterica utilizzando una pipetta multicanale e incubare con il coperchio a 25 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, sigillare la piastra di sospensione a 96 pozzetti con pellicola adesiva pulita e conservarla a 15 gradi Celsius per un massimo di cinque giorni.
Per iniziare, valutare lo stadio di sviluppo di una popolazione di vermi sincronizzati osservando le piastre. Una volta che più del 90% dei vermi ha raggiunto L quattro stadi, raccogliere i vermi in un massimo di 10 millilitri di soluzione sterile di M nove in tubi conici da 15 millilitri. Quindi, lavare ampiamente i vermi per quattro volte girando verso il basso a 142 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius, aggiungendo 10 millilitri di M fresco sterile nove tra ogni lavaggio per eliminare i batteri OP50.
Quindi rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di verme in 10 millilitri di M nove. Trasferire 50 microlitri di soluzione di vite senza fine in un tubo legante a bassa superficie da 1,5 o due millilitri contenente 950 microlitri di M nine. Dopo aver mescolato delicatamente il contenuto del tubo per evitare la sedimentazione del verme, utilizzare rapidamente una punta di pipetta a basso legame bagnata per trasferire da tre a quattro gocce separate da 10 microlitri su un vetrino o una piastra NGM.
Sotto un microscopio stereo con ingrandimento 16X, contare il numero di vermi e calcolare la media dei conteggi da tre a quattro gocce per determinare il numero di vermi per microlitro nella soluzione di vermi. Regolare la concentrazione di vite senza fine a 15 vermi per microlitro nel tubo conico da 15 millilitri. Quindi trasferire otto microlitri di soluzione di vite senza fine in ciascuno dei pozzetti delle otto piastre di agarosio NGM da 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale o una pipetta ripetuta.
Dopo 36 ore, erogare 30 microlitri di M nove in ciascun pozzetto della piastra del pozzetto 96. Successivamente, trasferire i worm sulla piastra del pozzetto 384 in base ai layout impostati utilizzando punte a bassa ritenzione, assicurandosi che i lettori di piastre siano impostati correttamente. Successivamente, rabboccare le piastre di 384 pozzetti con più M nove, mirando a un volume finale di 60 microlitri per pozzetto aggiungendo 40 microlitri di M nove per il saggio dello stress termico e 34 microlitri di M nove in sei microlitri di TBHP per lo stress ossidativo indotto da TBHP.
Quindi iniziare il test entro due minuti dall'aggiunta di TBHP. Quindi, chiudere le piastre con il loro coperchio trasparente e sigillare i bordi delle 384 piastre del pozzetto con nastro adesivo, assicurandosi che il nastro non passi sopra il coperchio o sotto la piastra. Quindi inserire la piastra nel lettore di piastre.
Determinare un valore di fluorescenza al di sotto del quale un picco non sarebbe significativamente diverso dal rumore e notare il primo punto temporale in cui le fluttuazioni di fluorescenza si smorzano prima di aumentare. Quindi notare i punti temporali tra i quali si prevede che i valori di fluorescenza minima e massima cadranno, poiché verranno utilizzati per il montaggio della curva. Successivamente, controlla se le ampiezze dei picchi di fluorescenza variano significativamente tra i pozzetti.
Normalizzare i dati prima di ulteriori analisi utilizzando la formula descritta nel manoscritto. Innanzitutto, scarica LFASS da GitHub, avvia MATLAB e vai alla cartella LFASS. Quindi digitare ed eseguire la cartella adatta nella finestra di comando, seguendo le istruzioni visualizzate.
Dopo aver digitato nella cartella di adattamento, digitare il nome della cartella dati in cui si trova il file Excel come I miei dati. Quindi immettere due per l'intervallo di tempo tra misurazioni successive nel protocollo corrente e digitare il valore di soglia di disturbo. Quindi, assegnare la soglia di tolleranza superiore digitando 0,94 e la soglia di tolleranza inferiore digitando 0,06 per vincolare l'adattamento sigmoideo.
Impostare intervalli di tempo per trovare i valori massimo e minimo. Per ispezionare visivamente i raccordi convergenti, digitare Y per sì o N per no per non visualizzare curve adattate e lisce quando richiesto. Quindi, fornire limiti di tempo nuovi, inferiori e superiori per tentare il refitting.
Se si desidera tentare il refit, digitare due. Tuttavia, se desiderate accettare il refit e passare alla curva successiva, immettete zero. Per scegliere se analizzare le curve identificate come rumore o rimontare curve mal adattate, sia il tipo Y per approvare e N per respingere.
Dopo che il refitting è stato tentato o rifiutato per tutte le curve rimanenti, il programma termina. Recuperare i file dei risultati dalla cartella dei risultati e salvarli come punto XLSX per l'analisi a valle. I saggi di resistenza al calore e allo stress ossidativo sono stati eseguiti su Bristol N, due vermi selvatici, che sono stati alimentati con isolati batterici MYB11 o MYB115 o batteri di controllo E coli OP50.
Dopo 36 ore, le popolazioni adulte di vermi selvatici sono state esposte a uno stress termico di 42 gradi Celsius e a uno stress ossidativo indotto da TBHP del 7%. Il tempo mediano di morte variava tra 40 e 130 minuti per il test dello stress termico e tra 90 e 240 minuti per il test dello stress ossidativo. Per assicurarsi che i vermi siano cresciuti nel passaggio 2.5 e che il passaggio 2.1 possa richiedere fino a due ore, disegnare una disposizione delle piastre per preparare i vermi da 96 pozzetti a 284 pozzetti nel passaggio 4.6.
I passaggi possono essere aggiunti o sostituiti. Ad esempio, gli screening dell'RNA a livello di genoma ospite o gli screening genetici batterici possono essere eseguiti sostituendo rispettivamente isolati di batteri intestinali per cloni di RNI o mutanti batterici. Quindi stiamo attualmente utilizzando questo approccio per identificare nuovi probiotici e scoprire reti di regolazione genica coinvolte nelle micro interazioni dell'ospite nel contesto delle infezioni e dell'invecchiamento.
