Siamo grati per gli sforzi significativi che il Dipartimento di Ingegneria della Colorado State University-Pueblo ha fornito nella costruzione della piegatrice a tre punti e della sua modifica in una macchina convertibile per prove di piegatura/compressione a tre punti. Siamo particolarmente grati al signor Paul Wallace, coordinatore dell'officina meccanica, per i suoi sforzi nella pianificazione e nell'esecuzione della costruzione e della modifica della macchina. Anche l'esperienza e il feedback del Dr. Bahaa Ansaf (Colorado State University-Pueblo, Dipartimento di Ingegneria) e della Dott.ssa Franziska Sandmeier (Colorado State University-Pueblo, Dipartimento di Biologia) hanno contribuito in modo significativo a questo progetto. L'Institute of Cannabis Research Grant della Colorado State University-Pueblo ha finanziato il progetto più ampio di cui faceva parte questo esperimento e ha permesso l'acquisto dei topi, dei reagenti e di alcune delle attrezzature utilizzate.

Tutti gli esperimenti e i protocolli sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health e hanno ricevuto l'approvazione dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Colorado State University-Pueblo (numero di protocollo: 000-000A-021). Le procedure dettagliate per la cura degli animali sono state descritte in precedenza 5,6. I topi sono stati ottenuti a tre settimane di età come parte di uno studio più ampio volto a studiare gli effetti di una dieta integrata con semi di canapa su topi C57BL/6 femmine giovani e in crescita (vedi Tabella dei materiali). Da 5 a 29 settimane di età, i topi sono stati allevati con una delle tre diete: controllo (0% semi di canapa), 50 g/kg (5%) semi di canapa, o 150 g/kg (15%) semi di canapa, con otto topi per gruppo 5,6. Durante lo studio, i topi hanno avuto accesso ad libitum alle rispettive diete e all'acqua, sono stati alloggiati in coppie in gabbie di policarbonato e mantenuti su un ciclo di 12 ore luce:12 ore di buio (con luci accese dalle 06:00 alle 18:00). Il peso e la salute dei topi sono stati valutati settimanalmente e tutti i topi hanno completato con successo lo studio senza sviluppare condizioni di salute avverse. A ventinove settimane di età, i topi sono stati anestetizzati in profondità con gas isoflurano e sottoposti a eutanasia tramite lussazione cervicale 5,6. È stata praticata un'incisione sulla linea mediana sulla superficie ventrale dallo sterno alla coda e tutti gli organi intratoracici, peritoneali e retroperitoneali sono stati rimossi dalle carcasse. Le carcasse eviscerate sono state conservate in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% a -70 °C fino al momento della dissezione ossea per il test delle vertebre, avvenuto circa un anno dopo.
1. Conversione di una piegatrice a tre punti in una macchina per prove di compressione
<ol><li>Svitare la traversa fissata al sensore di carico sulla piegatrice a tre punti7 (vedi Tabella dei materiali) (Figura 1A,B).</li>
	<li>Avvitare una piastra superiore autoallineante sul sensore di carico (vedere la tabella dei materiali) con filettatura identica alla traversa (Figura 1C).</li>
	<li>Praticare due fori orizzontali in ciascuno dei supporti inferiori, dove verrà fissata la piastra inferiore in un secondo momento (Figura 1D).</li>
	<li>Battere le filettature sui due lati di una piastra inferiore in acciaio inossidabile per allinearle con i fori praticati nei supporti inferiori (Figura 1E).</li>
	<li>Fissare la piastra inferiore ai due supporti inferiori utilizzando viti esagonali filettate e serrare fino a fissarla (Figura 1F). NOTA: Le viti esagonali devono avere filettature che corrispondano ai fori filettati sui supporti inferiori e sulle piastre superiore/inferiore. L'uso di una piastra superiore autoallineante può aiutare a ottenere un contatto uniforme tra la piastra superiore e la superficie di carico, ma non è sufficiente data la concavità dell'estremità cranica dei corpi vertebrali. È necessaria un'ulteriore preparazione con un metodo di preparazione del piano di carico. Quando si costruisce una macchina per prove di compressione per ossa di animali di piccole dimensioni, che sono più piccole e più deboli di molti materiali industriali/ingegneristici, è essenziale considerare la capacità di carico del sensore di carico e le dimensioni del telaio di carico. Inoltre, le macchine devono essere pulite e lubrificate regolarmente per garantire risultati accurati e un funzionamento regolare.</li>
</ol>2. Correzione dello spostamento della macchina per prove di compressione
<ol><li>Senza materiale di prova tra la piastra superiore e la piastra inferiore, abbassare la piastra superiore sulla piastra inferiore fino a quando non si è verificato un leggero contatto (~0,3-0,5 N forza di precarico).</li>
	<li>Accendere la macchina a una velocità di abbassamento costante (~1 mm/min) per iniziare la prova di compressione. Raccogliere le misure di carico (N) e spostamento (mm) utilizzando un software di raccolta dati digitale (vedere la tabella dei materiali) per la raccolta dei dati delle prove meccaniche. NOTA: Poiché non c'è materiale tra il piano superiore e quello inferiore, tutti gli spostamenti osservati saranno dovuti al solo spostamento della macchina (macchina Δx) (telaio, cella di carico, piani, giunti, ecc.).</li>
	<li>Continuare ad abbassare la piastra superiore sulla piastra inferiore a una velocità costante (cioè monotona) fino a raggiungere forze superiori a quelle che si otterranno da tutti i campioni ossei.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.3 per un totale di tre volte.</li>
	<li>Tracciare i dati per lo spostamento del sistema (macchina Δx, mm) rispetto a. carico applicato (Forza, N).</li>
	<li>Adattare una linea di regressione di adattamento ottimale ai dati (Figura 2A-D).</li>
	<li>In un foglio di calcolo con i dati di un test di compressione ossea, utilizzare l'equazione fornita dall'analisi di regressione per determinare la quantità di spostamento della macchina (macchina Δx) che influenza lo spostamento registrato (Δxtotale registrato) per un punto dati di un test di compressione della vertebra lombare del topo. NOTA: Si consideri, ad esempio, un punto dati in cui viene applicata una forza di 18 N e sono stati registrati 2.730 mm di spostamento (Δxtotale registrato). Secondo l'equazione di regressione polinomiale del terzo ordine di esempio (Figura 2D) [Δxmacchina = (4 × 10-7 x Carico applicato3) - (8 × 10-5 x Carico applicato2) + (0,0044 x Carico applicato)], 0,056 mm dello spostamento registrato è dovuto allo spostamento della macchina (macchina Δx). Δxtotale registrato= Δxmacchina + Δxprovino</li>
	<li>Correggere lo spostamento registrato per il punto dati. NOTA: Si consideri, ad esempio, l'esempio precedente. Se si registrano 2.730 mm di spostamento (Δxtotale registrato) e lo spostamento della macchina (macchina Δx) rappresenta 0,056 mm del totale, allora lo spostamento che il provino (cioè l'osso) di interesse ha subito (campione Δx) è 2.664 mm. Pertanto, 2.664 mm è lo spostamento effettivo che la vertebra ha subito (provino Δx) ed è il valore da utilizzare per l'analisi della curva carico-spostamento. Campione Δx = Δxtotale registrato - macchina Δx</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.7-2.8 per ogni punto dati raccolto per ogni singolo campione (osso). NOTA: Questo passaggio è importante perché durante la prova di compressione, lo spostamento osservato non è dovuto solo allo spostamento del provino, ma è invece una combinazione dello spostamento della macchina (macchina Δx) (ad esempio, compressione/spostamento del telaio, cella di carico, piastre, giunti, ecc.) e del provino (provino Δx). Pertanto, per gli esemplari che subiscono quantità relativamente piccole di spostamento, come quelli di un piccolo animale (ad esempio, un topo), lo spostamento del sistema (macchina Δx) può causare grandi errori. Le procedure qui descritte per correggere lo spostamento del sistema sono state precedentemente riportate da Kalidindi e Abusafieh28, che descrivono anche altri due metodi oltre a quello qui descritto. È stato notato che alcuni ricercatori utilizzano più di un metodo per determinare lo spostamento del sistema17. Ogni macchina può visualizzare modelli e gradi di spostamento del sistema univoci quando vengono applicati dei carichi. Per questo motivo, il fattore di correzione dello spostamento del sistema deve essere determinato per ogni macchina e non sarà lo stesso tra due macchine qualsiasi. A differenza della prova di compressione di un osso vertebrale, non si osserverà una grande riduzione della forza durante la misurazione dello spostamento del sistema perché non c'è materiale tra la piastra superiore e quella inferiore.</li>
</ol>3. Dissezione della 5a vertebra lombare (L5) dalla carcassa del topo
<ol><li>Scongelare la carcassa di topo congelata a temperatura ambiente, avendo cura di mantenere idratati i tessuti molli e le ossa applicando regolarmente una soluzione isotonica di NaCl allo 0,9%.</li>
	<li>Fai una piccola incisione (<0,5 cm) nella pelle sulla linea mediana dorsale vicino alla base della coda, quindi estendi il taglio su ciascun arto posteriore e tira delicatamente per rimuovere la pelle dalla base della coda alla testa dell'animale.</li>
	<li>Tagliare la muscolatura della parete addominale fino a quando la colonna vertebrale non è facilmente visibile.</li>
	<li>Sotto un microscopio da dissezione, visualizza le due articolazioni sacroiliache e l'estremità cranica dell'osso sacro.</li>
	<li>Usando una lama di rasoio o un bisturi, fai un taglio sottile per separare l'ultima vertebra lombare (L6) dall'estremità cranica dell'osso sacro.</li>
	<li>Ancora una volta, tagliando tra lo spazio intervertebrale, rimuovere L6 e L5 dalla colonna vertebrale, mettendo da parte L5 per l'analisi (Figura 3).</li>
	<li>Ispezionare la vertebra al microscopio da dissezione e rimuovere tutti i tessuti molli dall'osso, compreso il disco intervertebrale, utilizzando principalmente garze e delicatamente con una pinza dove necessario. NOTA: Nel presente studio, la L5 è stata scelta come vertebra di interesse, ma altre vertebre lombari possono essere scelte per i test di compressione.</li>
</ol>4. Preparazione della superficie di carico della vertebra L5 per la prova di compressione uniassiale utilizzando il metodo di inclusione del cemento osseo PMMA
<ol><li>Utilizzando un disco da taglio diamantato (vedere la tabella dei materiali) collegato a un utensile rotante, eseguire un taglio su ciascun peduncolo per rimuovere il processo trasversale e spinoso (Figura 4). Se lasciati attaccati al centro, i processi vertebrali possono provocare contatti locali con le piastre superiori/inferiori in corrispondenza dei processi stessi, al contrario di una distribuzione del carico in tutto il centro.</li>
	<li>Carteggiare delicatamente l'estremità caudale della vertebra utilizzando carta vetrata fine a grana 120 (vedi Tabella dei materiali) per rimuovere tutti i dischi intervertebrali, i tessuti molli e le irregolarità.</li>
	<li>Contrassegnare l'estremità caudale levigata con un pennarello indelebile per una facile identificazione in seguito.</li>
	<li>Miscelare il cemento osseo PMMA secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Con il cemento osseo in PMMA ancora semi-morbido, posizionarne una quantità minima sull'estremità cranica (non marcata) della vertebra rivolta verso l'alto, assicurandosi che l'intera superficie sia coperta mentre la vertebra si trova in un bagno salino per mantenere il campione osseo idratato e fresco.</li>
	<li>Con il PMMA ancora semimorbido, posizionare la vertebra sulla piastra inferiore con il lato caudale (marcato) rivolto verso il basso (Figura 5).</li>
	<li>Accendere la macchina per innestare gli ingranaggi di trasmissione e abbassare lentamente la piastra superiore sul complesso di cemento osseo vertebre + PMMA fino a quando non si entra in contatto con il cemento osseo e viene applicata una forza minima (<0,5 N) per distribuire uniformemente il PMMA sulla superficie ossea. La piastra superiore in posizione neutra può essere stimata come orizzontale e, quando si preme sul PMMA semi-morbido, farà sì che il PMMA riempia la concavità sull'estremità cranica della vertebra e formi una superficie orizzontale piatta sotto la piastra superiore.</li>
	<li>Con la piastra superiore che preme delicatamente sul cemento osseo in PMMA, lasciare riposare il campione indisturbato fino a quando il cemento osseo in PMMA non si è completamente indurito (~10 minuti secondo le istruzioni del produttore per il cemento osseo in PMMA utilizzato nel presente studio). Conservare il campione in un bagno salino o nebulizzarlo frequentemente con soluzione fisiologica durante questo periodo per mantenere il campione idratato e fresco.</li>
	<li>Una volta che il cemento osseo in PMMA si è completamente indurito, si può iniziare la prova di compressione. Raccogli i dati per il carico (cioè la forza) (N) e lo spostamento (cioè la deflessione) (mm) dai sensori in un foglio di calcolo in tempo reale utilizzando un software digitale progettato per la raccolta dei dati dei test meccanici (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Dopo la raccolta dei dati di base per 5 s, applicata a una forza di precarico minima di <0,5 N, iniziare ad abbassare la piastra superiore sul campione a una velocità di abbassamento singola (cioè monotona) predeterminata per avviare la prova di compressione (~1 mm/min).</li>
	<li>Interrompere la raccolta dei dati una volta osservata una forte riduzione del carico (N), che indica un cedimento del materiale. NOTA: Le istruzioni del produttore specificano il tempo approssimativo di indurimento per il cemento osseo PMMA. Il tempo di indurimento del cemento osseo in PMMA può variare a seconda del tipo di cemento osseo in PMMA utilizzato. Seguire le istruzioni del produttore per determinare il tempo di attesa per l'indurimento del PMMA. Tuttavia, come indicatore che il cemento osseo PMMA si è completamente indurito, è possibile miscelare un ulteriore campione di cemento osseo PMMA contemporaneamente al campione che verrà posizionato sulla vertebra ma tenuto da parte e controllato per vedere se è ancora morbido o completamente indurito. Se completamente indurito, questo può indicare che anche il PMMA sull'osso è completamente indurito senza disturbare il complesso osso + PMMA. Il campione osseo deve rimanere ben idratato e fresco durante i periodi di indurimento e test del PMMA. Bastano pochi minuti di esposizione all'aria secca per modificare le proprietà biomeccaniche. Alcuni ricercatori utilizzano macchine per prove di compressione dotate di un bagno salino19. La macchina per prove di compressione non aveva un bagno salino nel presente studio. Invece, una sottile nebbia di soluzione salina è stata regolarmente applicata durante il periodo di indurimento del PMMA e il periodo di prova.</li>
</ol>5. Analisi delle curve carico-spostamento per prove di compressione uniassiale della vertebra L5
<ol><li>Copia e incolla i dati di carico (N) e di spostamento corretto (mm) dal foglio di calcolo in un software di grafici tecnici e analisi dei dati (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Generare un grafico con il carico (N) sull'asse y e lo spostamento corretto del provino (provino Δx, mm) sull'asse x (Figura 6). Fallo nel software facendo prima clic su Windows, Nuova tabella, quindi Fallo per creare una tabella. Copiare i dati di spostamento (mm) e caricamento (N) corretti dal foglio di calcolo dei dati grezzi nella nuova tabella.</li>
	<li>Successivamente, generare una forma d'onda per rappresentare i dati grezzi facendo clic su Dati, quindi fare clic su Coppia XY a forma d'onda e selezionare i dati di spostamento corretti per l'onda X e caricare i dati per l'onda Y. Assicurati che il numero corretto di punti dati sia nella casella "Numero di punti", assegna un nome alla forma d'onda, quindi fai clic su Crea forma d'onda. Una volta creata una forma d'onda, generare un grafico facendo clic su Windows, quindi su Nuovo grafico e posizionare la forma d'onda sull'asse Y e "calcolata" sull'asse X.</li>
	<li>Utilizzare lo strumento cursore per contrassegnare punti/regioni di interesse sul grafico per l'analisi. Alcuni dei punti/regioni di interesse per calcolare le proprietà meccaniche comuni dell'osso intero sono menzionati nei passaggi 5.4-5.8 (Figura 6) e includono il lavoro a rottura (N x mm), il carico massimo (N), la rigidità (N/mm), il carico di snervamento (N) e lo spostamento post-snervamento (mm).</li>
	<li>Per il calcolo del lavoro a rottura (N x mm), posizionare un cursore (A) all'inizio della prova e un cursore (B) nel punto immediatamente prima che il materiale si rompa (cioè al carico massimo raggiunto durante la prova prima che si osservi una forte diminuzione del carico). NOTA: Pertanto, i cursori A-B metteranno tra parentesi l'intero test dal momento in cui il materiale inizia a resistere alle forze e subisce lo spostamento fino al punto in cui il materiale si rompe. Il work-to-failure (N x mm) può essere misurato come l'area totale sotto la curva (cioè l'area sotto la curva tra i cursori A e B).</li>
	<li>Calcolare il carico massimo (N) come il valore più alto per il carico osservato durante la prova (cioè il carico sul cursore B).</li>
	<li>Calcolare la rigidezza (N/mm) del materiale come pendenza della regione elastica lineare (cioè la pendenza tra i cursori C e D).</li>
	<li>Il carico di snervamento (N) è il carico al quale la curva carico-spostamento si discosta dalla linearità ed entra nella regione plastica, sostenendo così una deformità permanente (cioè carico nel punto D). Calcolalo misurando il carico sul cursore D.</li>
	<li>Lo spostamento post-snervamento (mm) è un indicatore della duttilità di un materiale. Misurarlo come lo spostamento tra il punto di snervamento e il punto di rottura del materiale (cioè lo spostamento tra i cursori D e B). NOTA: I parametri sopra elencati sono solo alcune delle comuni proprietà meccaniche dell'osso intero riportate. Non è un elenco completo di tutte le proprietà meccaniche dell'osso intero che possono essere ottenute da una curva carico-spostamento. Altri parametri delle proprietà meccaniche dell'osso intero includono lo spostamento totale (mm), l'energia elastica assorbita (N x mm), lo spostamento elastico (mm), l'energia plastica assorbita (N x mm) e lo spostamento plastico (mm), solo per citarne alcuni. Inoltre, le proprietà meccaniche ossee a livello tissutale non sono elencate; Questi richiedono trasformazioni di dati utilizzando misurazioni anatomiche specifiche, come il diametro osseo. Il codice di esempio per effettuare le misurazioni dalla curva carico-spostamento nel software è stato elencato nel file supplementare 1.</li>
</ol>

Test di compressione della vertebra di topo per la determinazione della resistenza meccanica

<ol>
	<li>Kemmak, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+osteoporosis+in+the+world:+A+systematic+review.">Economic burden of osteoporosis in the world: A systematic review.</a> Medical Journal of The Islamic Republic of Iran. 34, 153 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+bone+remodeling+levels+of+trabecular+and+cortical+bone+in+response+to+changes+in+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+mice.">Different bone remodeling levels of trabecular and cortical bone in response to changes in Wnt/&#946;-catenin signaling in mice.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 812-819 (2016).</li><li>Crandall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parathyroid+hormone+for+treatment+of+osteoporosis.">Parathyroid hormone for treatment of osteoporosis.</a> JAMA Internal Medicine. 162 (20), 2297-2309 (2002).</li><li>Ott, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+or+trabecular+bone:+what's+the+difference.">Cortical or trabecular bone: what's the difference.</a> American Journal of Nephrology. 47 (6), 373-375 (2018).</li><li>Sparks, C. A., Streff, H. M., Williams, D. W., Blanton, C. A., Gabald&#243;n, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+hempseed+decreases+femur+maximum+load+in+a+young+female+C57BL/6+mouse+model+but+does+not+influence+bone+mineral+density+or+micro-architecture.">Dietary hempseed decreases femur maximum load in a young female C57BL/6 mouse model but does not influence bone mineral density or micro-architecture.</a> Nutrients. 14 (20), 4224 (2022).</li><li>Blanton, C. A., Barrott, J. J., Kunz, K., Bunde, E., Streff, H. M., Sparks, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Hempseed+Consumption+on+Bone+Parameters+and+Body+Composition+in+Growing+Female+C57BL/6+Mice.">The Impact of Hempseed Consumption on Bone Parameters and Body Composition in Growing Female C57BL/6 Mice.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5839 (2022).</li><li>Sarper, H., Blanton, C., Depalma, J., Melnykov, I. V., Gabald&#243;n, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+weightlessness+and+synbiotic+diet+effects+on+rat+bone+mechanical+strength.">Simulated weightlessness and synbiotic diet effects on rat bone mechanical strength.</a> Life Sciences in Space Research. 3, 45-54 (2014).</li><li>Choman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+a+synbiotic+diet+on+the+structure+and+strength+of+cortical+bone+in+aging+male+mice.">The Effect of a synbiotic diet on the structure and strength of cortical bone in aging male mice.</a> , (2015).</li><li>Sparks, C. A., Giltner, Z. T., Blanton, C. A., Gabald&#243;n, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+a+synbiotic+diet+on+humerus+bone+mineralization+and+mechanical+strength+in+aging+male+mice.">The Effects of a synbiotic diet on humerus bone mineralization and mechanical strength in aging male mice.</a> El R&#237;o. 4 (1), 3-12 (2021).</li><li>Bilezikian, J. P., Martin, T. J., Clemens, T. L., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of bone biology (Fourth Edition). , (2019).</li><li>Jepsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+biomechanical+mechanisms+in+mouse+models:+practical+guidelines+for+systematically+evaluating+phenotypic+changes+in+the+diaphyses+of+long+bones.">Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).</li><li>Vashith, D., Tanner, K. E., Bonfield, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution,+development+and+morphology+of+microcracking+in+cortical+bone+during+crack+propagation.">Contribution, development and morphology of microcracking in cortical bone during crack propagation.</a> Journal of Biomechanics. 33 (9), 1169-1174 (2000).</li><li>Turner, C. H., Burr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+biomechanical+measurements+of+bone:+A+tutorial.">Basic biomechanical measurements of bone: A tutorial.</a> Bone. 14 (4), 595-608 (1993).</li><li>Warriner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+fractures+are+most+attributable+to+osteoporosis.">Which fractures are most attributable to osteoporosis.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (1), 46-53 (2011).</li><li>Donally, C. I., DiPompeo, C., Varcallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebral compression fractires. , (2022).</li><li>Alhadhoud, M., Alsiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+spinal+fractures+in+a+level+2+trauma+center+in+Kuwait.">The epidemiology of spinal fractures in a level 2 trauma center in Kuwait.</a> SAGE Open Medicine. 9, 1-11 (2021).</li><li>Schumancher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparison of two loading surface preparation methods on rat vertebral bodies for compression testing. , (2013).</li><li>Rathore, M., Sharma, D., Sinha, M., Siddiqui, A., Trivedi, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+review+-+thoracolumbar+spine:+anatomy,+biomechanics+and+clinical+significance.">Focused review - thoracolumbar spine: anatomy, biomechanics and clinical significance.</a> Indian Journal of Clinical Anatomy and Physiology. 1 (1), 41-48 (2014).</li><li>Pendleton, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+method+for+cyclic+loading+of+small-animal+vertebrae+to+assess+bone+quality.">High-precision method for cyclic loading of small-animal vertebrae to assess bone quality.</a> Bone Reports. 9, 165-172 (2018).</li><li>Lundon, K., Bolton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+lumbar+intervertebral+disk+in+health,+aging,+and+pathologic+conditions.">Structure and function of the lumbar intervertebral disk in health, aging, and pathologic conditions.</a> Journal of Orthopaedic &amp; Sports Physical Therapy. 31 (6), 291-306 (2011).</li><li>Sharir, A., Barak, M. M., Shahar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+bone+mechanics+and+mechanical+testing.">Whole bone mechanics and mechanical testing.</a> The Veterinary Journal. 177 (1), 8-17 (2008).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+compression+testing+for+measuring+the+stiffness+of+human+bone.">Standardizing compression testing for measuring the stiffness of human bone.</a> Bone &amp; Joint Research. 7 (8), 524-538 (2018).</li><li>Akhter, M. P., Jung, L. K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+bone+strength+in+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+spondyloarthropathy.">Decreased bone strength in HLA-B27 transgenic rat model of spondyloarthropathy.</a> Rheumatology. 46 (8), 1258-1262 (2007).</li><li>Shahnazari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+doses+of+bisphosphonates+further+improve+bone+mass,+architecture,+and+strength+but+not+the+tissue+material+properties+in+aged+rats.">Higher doses of bisphosphonates further improve bone mass, architecture, and strength but not the tissue material properties in aged rats.</a> Bone. 46 (5), 1267-1274 (2011).</li><li>Chachra, D., Kasra, M., Vanin, C., MacLusky, N., Casper, R., Grynpas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+different+hormone+replacement+therapy+regimens+on+the+mechanical+properties+of+rat+vertebrae.">The effect of different hormone replacement therapy regimens on the mechanical properties of rat vertebrae.</a> Calified Tissue International. 56 (2), 130-134 (1995).</li><li>Bushinsky, D. A., Willet, T., Asplin, J. R., Culbertson, C., Sara, C., Grynpas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorthalidone+improves+vertebral+bone+quality+in+genetic+hypercalciuric+stone-forming+rats.">Chlorthalidone improves vertebral bone quality in genetic hypercalciuric stone-forming rats.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1904-1912 (2011).</li><li>Fujiwara, T., Akeda, K., Yamada, J., Kondo, T., Sudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endplate+and+intervertebral+disc+injuries+in+acute+and+single+level+osteoporotic+vertebral+fractures:+is+there+any+association+with+the+process+of+bone+healing.">Endplate and intervertebral disc injuries in acute and single level osteoporotic vertebral fractures: is there any association with the process of bone healing.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 20 (1), 336 (2019).</li><li>Kalidindi, S. R., Abusafieh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+characterization+of+machine+compliance+for+simple+compression+testing.">Accurate characterization of machine compliance for simple compression testing.</a> Experimental Mechanics. 37 (2), 210-215 (1997).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

L'obiettivo del presente studio è stato quello di descrivere la costruzione di una macchina di piegatura a tre punti/macchina per prove di compressione convertibile, nonché l'uso di un metodo di inclusione di cemento osseo in PMMA per la preparazione di campioni di vertebre lombari di topo prima della prova di compressione uniassiale. Per i campioni ossei sono state ottenute e riportate statistiche descrittive, che saranno utili per il confronto in studi futuri. Nel presente studio sono state analizzate alcune delle proprietà meccaniche dell'osso intero più comunemente riportate. Tuttavia, vale la pena notare che ci sono diverse proprietà meccaniche aggiuntive a livello di osso intero e tessuto che non sono state studiate qui.
Non è chiaro come le proprietà meccaniche ottenute dai campioni preparati con il metodo di inclusione si confrontino con quelle preparate con il metodo di taglio per le vertebre lombari di topo. Schumancher17 ha precedentemente valutato le proprietà meccaniche delle vertebre di ratto preparate utilizzando i due diversi metodi e ha scoperto che le vertebre preparate utilizzando il metodo di inclusione avevano una rigidità significativamente inferiore, uno spostamento di snervamento più elevato e una deformazione di snervamento più elevata rispetto ai campioni preparati con il metodo di taglio. È necessaria un'ulteriore caratterizzazione per capire come le proprietà meccaniche vertebrali dei topi o di altri modelli animali si confrontano quando vengono misurate utilizzando i due diversi metodi di preparazione della superficie di carico. Ci si aspetta che alcuni parametri differiscano tra le vertebre preparate con metodi diversi, dato che il metodo di inclusione aggiunge materiale al campione ma preserva la placca terminale, che è una struttura importante nelle fratture vertebrali in vivo17,27. L'aggiunta di cemento osseo all'estremità cranica aggiunge altezza al campione, mentre il taglio delle piastre terminali rimuove l'altezza, alterando il rapporto d'aspetto e quindi modificando le proprietà meccaniche come la rigidità. Inoltre, sebbene il PMMA sia più rigido dell'osso spongioso vertebrale, è possibile che il PMMA subisca uno spostamento e l'entità di questo spostamento necessita di un'ulteriore caratterizzazione. Inoltre, non è chiaro come i risultati ottenuti dal metodo di inclusione o dal metodo di taglio si confrontino con le previsioni dei parametri ossei utilizzando l'analisi degli elementi finiti per le vertebre del topo o come i risultati varino in condizioni diverse (ad esempio, velocità di abbassamento, diversi livelli vertebrali, composizioni di PMMA). Tuttavia, poiché tutti i campioni sono preparati in modo simile, questo metodo è appropriato e consente un mezzo semplice ed economico per effettuare confronti tra gruppi di trattamento in un unico studio in cui i campioni vengono preparati e testati in condizioni simili.
Per quanto riguarda la preparazione del campione prima della prova di compressione, è essenziale preparare i campioni in modo riproducibile. Una possibile limitazione del metodo descritto nel presente studio è l'uso di uno strumento rotante per rimuovere i processi vertebrali. Un altro metodo per rimuovere i processi vertebrali delle vertebre lombari di topo è stato descritto da Pendleton et al.19, che può consentire una preparazione del campione più coerente. Inoltre, possono derivare incongruenze dall'applicazione del cemento osseo PMMA. Pertanto, è importante applicare il cemento osseo in modo coerente in termini di volume, posizionamento e tempo di indurimento. Tuttavia, il metodo di inclusione può fornire un mezzo più semplice per ottenere una preparazione coerente del campione rispetto al metodo di taglio, poiché può essere difficile ottenere tagli perfettamente uniformi e paralleli in modo coerente tra tutti i campioni a causa delle loro piccole dimensioni e fragilità. Saranno necessari studi futuri per valutare la precisione dei risultati ottenuti da campioni preparati utilizzando l'embedding vs. metodo di taglio.
Come accennato, sono necessarie ulteriori caratterizzazioni e indagini sul metodo di inclusione per la preparazione dei campioni delle vertebre lombari di topo prima della prova di compressione uniassiale. Ciononostante, questo studio dimostra che tale metodo può essere impiegato, fornisce una descrizione dettagliata del metodo proposto e offre statistiche descrittive dei parametri misurati da campioni preparati utilizzando il metodo. Questo protocollo è prezioso per il settore a causa dell'attuale mancanza di metodologia disponibile. Inoltre, questo metodo può imitare meglio il meccanismo con cui si verificano le fratture vertebrali in vivo rispetto ad altri metodi17,27. Il metodo ha anche il vantaggio di superare le difficoltà tecniche associate ad altri metodi attualmente riportati, rendendo i test di compressione uniassiale più fattibili nella ricerca ossea. Ciò è particolarmente significativo perché farmaci, diete o altri interventi possono influenzare in modo diverso le ossa ricche di corticali (ad esempio, le ossa lunghe della diafisi mediana) e le ossa ricche di trabecolo (ad esempio, i corpi vertebrali), ma la flessione a tre punti è il metodo predominante per valutare le proprietà meccaniche delle ossa13. La combinazione di prove di flessione a tre punti e di compressione uniassiale può diventare ancora più facilmente realizzabile attraverso l'uso di una macchina di prova di flessione/compressione a tre punti convertibile. Pertanto, il presente studio propone due possibili mezzi per rendere più disponibile ai ricercatori la valutazione sia dell'osso ricco di corticali che di quello ricco di trabecolare nello stesso studio, portando potenzialmente a una migliore comprensione di come un determinato trattamento influisce su diversi tipi di osso tra i gruppi sperimentali.

I cambiamenti ossei legati all'età sono ampiamente riconosciuti come problematici a causa dell'aumento del rischio di fratture ossee associate a questi cambiamenti. Le fratture ossee nell'uomo possono portare a dolore cronico, mobilità ridotta, disabilità a lungo termine, aumento del rischio di morte e oneri economici1. Le terapie comuni studiate per affrontare i sintomi dei cambiamenti ossei legati all'età includono integratori alimentari, trattamenti ormonali e farmaci 2,3,4,5,6,7,8,9. Le indagini iniziali su tali trattamenti per soggetti umani sono comunemente condotte utilizzando piccoli modelli animali (ad esempio, ratti e topi da laboratorio), che possiedono i due principali tipi di ossa presenti nello scheletro umano10. Le ossa lunghe appendicolari, come l'omero, il femore e la tibia, sono ricche di osso corticale (cioè compatto), mentre le vertebre sono ricche di osso spongioso (cioè osso intrecciato, spugnoso o trabecolare)4. È sempre più noto che i meccanismi di regolazione ossea e le vie di segnalazione differiscono tra l'osso corticale (ad esempio, l'osso lungo della diafisi mediana) e l'osso spongioso (ad esempio, il centro vertebrale)2. Per questo motivo, le terapie possono avere effetti differenziali che sono specifici per l'osso o addirittura sito-specifici all'interno dello stesso osso 2,3,4.
L'applicazione di una forza a un oggetto (ad esempio, l'osso) fa sì che l'oggetto subisca accelerazione, deformazione o entrambe, a seconda delle condizioni al contorno dell'oggetto. Quando l'osso è vincolato, una forza opposta di uguale grandezza resiste all'accelerazione dell'osso e si verifica la deformazione. Quando l'osso subisce una deformazione, si genera una resistenza interna chiamata stress, di cui esistono due tipi fondamentali: forza normale, sotto forma di tensione o compressione, e forza di taglio10. Spesso, viene generata una combinazione dei tipi di sollecitazione di base, a seconda del sistema di forze applicate10. La forza di un materiale è la sua capacità di resistere alle sollecitazioni senza cedere. Man mano che forze sempre maggiori vengono applicate a un materiale, alla fine subisce una deformazione permanente, a quel punto si dice che sia passato da uno stato elastico (cioè, tornerà alla sua forma originale se la forza viene rimossa) a uno stato plastico (cioè, non tornerà alla sua forma originale se la forza viene rimossa)11. Il punto in cui si verifica la transizione da uno stato elastico a uno stato plastico è chiamato punto di snervamento. Man mano che vengono applicate forze ancora maggiori al materiale oltre il punto di snervamento, esso subisce sempre più microfratture (cioè danni) fino a quando non si verifica la frattura totale; A questo punto, si dice che il materiale non è riuscito11,12. La frattura di un osso rappresenta un cedimento sia a livello strutturale che a livello tissutale10. Ad esempio, la rottura di un osso vertebrale si verifica perché non solo più trabecole falliscono a livello strutturale, ma c'è anche un fallimento di elementi della matrice extracellulare come i cristalli di collagene e idrossiapatite in una trabecola individuale a livello tissutale.
Gli eventi meccanici che portano al cedimento di un materiale possono essere misurati utilizzando una varietà di metodi di prova. La flessione a tre punti è un metodo comune per testare le proprietà meccaniche delle ossa lunghe dello scheletro appendicolare. Questo metodo è semplice e riproducibile, il che lo rende il metodo preferito di test biomeccanici da molti ricercatori13. Abbassando una trave a croce sulla diafisi mediana di un osso lungo appoggiato su due travi di supporto inferiori, questo metodo testa in modo specifico le proprietà meccaniche della regione della diafisi mediana, che è un osso corticale densamente organizzato. Dalle curve carico-spostamento, è possibile determinare gli effetti della forza di trazione sull'elasticità, la tenacità, la forza a rottura e la transizione dal comportamento elastico a quello plastico dei materiali ossei, tra le altre proprietà.
Nel secondo tipo di osso, indicato come osso trabecolare, spugnoso, intrecciato o spongioso, gli elementi ossei sono formati in una serie di aste e travi chiamate trabecole, dando un aspetto "spugnoso". I principali corpi vertebrali (cioè i centri) sono ricchi di osso spongioso e sono spesso i siti di fratture ossee da compressione legate all'età nell'uomo14. Le vertebre lombari (cioè la parte bassa della schiena) sono le vertebre più grandi, sopportano la maggior parte del peso del corpo e sono il sito più comune per le fratture vertebrali15,16. Le proprietà meccaniche dei corpi vertebrali possono essere valutate direttamente utilizzando metodi di prova di compressione uniassiale poiché la compressione assiale è il normale carico di forza imposto alle colonne vertebrali in vivo17. La compressione dei corpi vertebrali in vivo si verifica a causa delle contrazioni muscolari e legamentose, della forza di gravità e delle forze di reazione al suolo18.
I test di compressione ex vivo di piccole vertebre animali possono essere difficili a causa delle loro piccole dimensioni, della forma irregolare e della fragilità. La forma dei corpi vertebrali può essere stimata come un parallelogramma con lieve inclinazione ventrale e leggera concavità cranica17. Questa forma presenta sfide per ottenere prove di compressione uniassiale ex vivo perché, senza un'adeguata preparazione alla superficie di carico, le forze di compressione verranno applicate solo a una parte della superficie di carico, con conseguente "contatto locale"17,19. Ciò può causare risultati incoerenti e guasti prematuri19. Questo non è il caso in vivo perché la superficie di carico è circondata da dischi intervertebrali in corrispondenza delle articolazioni vertebrali, il che consente di distribuire il carico in tutta la placca terminale cranica. Il complesso disco intervertebrale-placca terminale cranica svolge un ruolo importante nell'applicazione della forza in tutto il corpo vertebrale e nella biomeccanica della frattura al corpo vertebrale14,20. Sebbene i test di compressione non siano nuovi nel campo della biologia, ci sono limitazioni negli attuali metodi di test meccanici delle ossa. Queste limitazioni includono la mancanza di modelli predittivi e simulazioni per la meccanica ossea, un'architettura spaziale geometrica unica e persino variazioni biologiche intrinseche basate su campioni21. Ancora più importante, il campo è messo alla prova da una mancanza di standardizzazione tra i metodi e da una generale mancanza di metodi riportati in letteratura22.
Esistono due metodi riportati in letteratura per la preparazione delle vertebre lombari dei roditori per ottenere prove di compressione uniassiale: il metodo di taglio e il metodo di inclusione 17,19,23,24,25,26. Il metodo di taglio richiede che i processi vertebrali, la placca terminale cranica e la placca terminale caudale vengano tagliati dal corpo vertebrale. Pendleton et al.19 hanno precedentemente riportato un metodo dettagliato per l'uso di questo metodo sulle vertebre lombari del topo. Questo metodo presenta la sfida di ottenere tagli perfettamente paralleli sia alla placca caudale che a quella cranica, evitando al contempo danni al campione. Ha anche la limitazione che la placca terminale cranica viene rimossa. La placca terminale cranica contiene un denso guscio di osso corticale e svolge un ruolo importante nella distribuzione dei carichi dai dischi intervertebrali in vivo ed è coinvolta nel cedimento dell'osso per le fratture in vivo 17,20,27. Al contrario, il metodo di inclusione comporta la rimozione dei processi vertebrali mantenendo intatta la placca terminale cranica del corpo vertebrale. La superficie di carico viene quindi resa approssimativamente orizzontale posizionando una piccola quantità di cemento osseo sull'estremità cranica del corpo vertebrale. Questo metodo ha il vantaggio di superare le sfide tecniche associate al metodo di taglio e può imitare meglio il meccanismo di applicazione del carico e di cedimento osseo in vivo grazie alla conservazione della placca terminale cranica. Questo approccio è stato precedentemente documentato in studi che hanno coinvolto test di compressione uniassiale su ossa di ratto. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, non è stato precedentemente documentato nel contesto delle vertebre lombari di topo più piccole 17,25,26. Il metodo in questione è stato precedentemente dettagliato da Chachra et al.25 e originariamente utilizzava un campione osseo tenuto tra due piastre, ciascuna con una cavità cilindrica, che è stata poi riempita con polimetilmetacrilato (PMMA). Lo stesso gruppo di ricerca ha successivamente migliorato il metodo in cui un'estremità viene levigata delicatamente (caudale) e l'altra estremità ha una piccola macchia di cemento osseo aggiunto (cranio)26. Questo metodo è un miglioramento rispetto al metodo precedente perché riduce al minimo il materiale tra i piani ed è l'obiettivo di questo articolo. Nonostante le sfide associate ai test di compressione vertebrale uniassiale, si tratta di un metodo che può fornire informazioni preziose sugli effetti di una terapia proposta sull'osso, soprattutto se abbinato alla flessione a tre punti.
Qui viene presentato l'uso di una macchina di prova di flessione/compressione a tre punti convertibile per consentire un facile test sia delle ossa lunghe che dei corpi vertebrali utilizzando un'unica macchina. Inoltre, viene presentato l'uso di un metodo di inclusione per ottenere test di compressione uniassiale delle vertebre lombari del topo. Il presente studio è stato eseguito come parte di uno studio più ampio che mirava a indagare le influenze dell'integrazione alimentare di semi di canapa sulle proprietà dell'osso scheletrico nei topi C57BL/6 femminagiovani e in crescita 5,6. Il tester di flessione a tre punti è stato originariamente costruito da docenti e studenti del Dipartimento di Ingegneria della Colorado State University-Pueblo e utilizzato dal nostro gruppo di ricerca nei test di flessione a tre punti su ossa lunghe [femore e tibiadi ratto 7 e omero, femore e tibia di topo 5,6,8,9]. Tuttavia, la sua modifica e applicazione per l'uso nei test di compressione del corpo vertebrale del topo non è stata esplorata. La progettazione e la costruzione della piegatrice a tre punti sono state descritte in precedenza7. Questo rapporto si concentrerà sui metodi utilizzati per modificare la macchina per le prove di compressione e per correggere lo spostamento del sistema. In secondo luogo, viene descritto il metodo di inclusione per la preparazione della superficie di carico del corpo vertebrale del topo, insieme ai metodi per le prove di compressione uniassiale e l'analisi dei dati di carico-spostamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>120-Grit Sand Paper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-bit Load Cell Interface</td>
			<td>LoadStar Sensors, Freemont, California, USA</td>
			<td>DQ-1000</td>
			<td>To connect load and displacement sensors to personal coputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base Mouse Diet</td>
			<td>Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>AIN-93G</td>
			<td>Diet the mice were fed, without added hempseed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool</td>
			<td>Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA</td>
			<td>F0130200AK</td>
			<td>To remove vertebral proccesses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Displacement Sensor</td>
			<td>Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA</td>
			<td>ID-S112EX</td>
			<td>Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Variable Voltage Power Source</td>
			<td>Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA</td>
			<td>382213</td>
			<td>To provide power to compression testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6 Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA</td>
			<td>027 (Strain Code)</td>
			<td>Mouse model used in present study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hempseed</td>
			<td>Natera, Pitt Meadows, Canada</td>
			<td>670834012199</td>
			<td>Hempseed added to Base Mouse Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro Software (Version 8.04)</td>
			<td>Wave Metrics, Portland, Oregon, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sofware used for load-displacement curve analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLoad Mini Force Sensor</td>
			<td>LoadStar Sensors, Freemont, California, USA</td>
			<td>MFM-010-050-S</td>
			<td>Load (force) sensor with 1.0% accuracy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic (0.9%) Saline Solution</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To keep bone sampels hydrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EZ4 W Miscoscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>NC1601884</td>
			<td>For bone dissections and vertebral process removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For data transfer from SensorVue software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PALACOS R Bone Cement</td>
			<td>Hareus Medical, Wehreim, Germany</td>
			<td>00-1112-140-01</td>
			<td>PMMA bone cement for embedding of the loading surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensorVue Software</td>
			<td>LoadStar Sensors, Freemont, California, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software used for real-time data collection during compression testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Dissecting Kit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-Point Bending Machine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse lumbar vertebra uniaxial compression testing with embedding of the loading surface

C'è una crescente consapevolezza che l'osso corticale e l'osso spongioso differiscono nella regolazione e nella risposta alle terapie farmacologiche, alle terapie ormonali e ad altri trattamenti per la perdita ossea legata all'età. La flessione a tre punti è un metodo comune utilizzato per valutare l'influenza di un trattamento sulla regione della diafisi media delle ossa lunghe, che è ricca di osso corticale. I test di compressione uniassiale delle vertebre dei topi, sebbene in grado di valutare le ossa ricche di osso spongioso, sono meno comunemente eseguiti a causa di sfide tecniche. Ancora meno comunemente eseguito è l'accoppiamento di test di flessione e compressione a tre punti per determinare in che modo un trattamento può influenzare la regione della diafisi media di un osso lungo e un centro vertebrale in modo simile o diverso. Qui, descriviamo due procedure per rendere il test di compressione delle vertebre lombari del topo un metodo meno impegnativo da eseguire in parallelo con la flessione a tre punti: in primo luogo, una procedura per convertire una macchina di piegatura a tre punti in una macchina per prove di compressione e, in secondo luogo, un metodo di inclusione per preparare una superficie di carico della vertebra lombare del topo.

Age-related bone changes are widely recognized as problematic due to the increased risk of bone fractures associated with these changes. Bone fractures in humans can lead to chronic pain, reduced mobility, long-term disability, an increased risk of death, and economic burdens1. Common therapies investigated to address the symptoms of age-related bone changes include dietary supplements, hormone treatments, and drugs2,3,4,5,6,7,8,9. Initial investigations of such treatments for human subjects are commonly done using small animal models (e.g., laboratory rats and mice), which possess the two major types of bones found in the human skeleton10. Appendicular long bones, such as the humerus, femur, and tibia, are rich in cortical (i.e., compact) bone, whereas vertebrae are rich in cancellous bone (i.e., woven, spongy, or trabecular bone)4. There is growing knowledge that the mechanisms of bone regulation and signaling pathways differ between cortical bone (e.g., long bone mid-diaphysis) and cancellous bone (e.g., vertebral centrum)2. Because of this, therapies may have differential effects that are bone-specific or even site-specific within the same bone2,3,4.
The application of force to an object (e.g., bone) causes the object to undergo acceleration, deformation, or both, depending on the object&#39;s boundary conditions. When the bone is constrained, an opposite force of equal magnitude resists the acceleration of the bone, and deformation occurs. As the bone sustains deformation, internal resistance called stress is generated, of which there are two basic types: Normal force, in the form of tension or compression, and shear force10. Often, a combination of the basic types of stress is generated, depending on the applied force system10. The strength of a material is its ability to withstand stress without failing. As increasingly larger forces are applied to a material, it eventually undergoes permanent deformation, at which point it is said to have transitioned from an elastic state (i.e., will return to its original shape if the force is removed) to a plastic state (i.e., will not return to its original shape if the force is removed)11. The point at which the transition from an elastic state to a plastic state occurs is called the yield point. As even larger forces are applied to the material beyond the yield point, it increasingly sustains microfractures (i.e., damage) until total fracture occurs; at this point, the material is said to have failed11,12. The fracture of a bone represents a failure at both a structural level and a tissue level10. As an example, the breakage of a vertebral bone happens because not only do multiple trabeculae fail at a structural level, but there&#39;s also a failure of extracellular matrix elements like collagen and hydroxyapatite crystals in an individual trabecula at the tissue level.
The mechanical events leading up to the failure of a material can be measured using a variety of testing methods. Three-point bending is a common method for testing the mechanical properties of long bones from the appendicular skeleton. This method is simple and reproducible, making it the preferred method of biomechanical testing for many researchers13. By lowering a crosshead beam onto the mid-diaphysis of a long bone resting on two lower support beams, this method specifically tests the mechanical properties of the mid-diaphysis region, which is densely organized cortical bone. From load-displacement curves, tensile force effects on elasticity, toughness, force to failure, and the transition from elastic to plastic behavior of bone materials, among other properties, can be determined.
In the second type of bone, referred to as trabecular, spongy, woven, or cancellous bone, bone elements are formed into an array of rods and beams called trabeculae, giving a &#34;spongy&#34; appearance. The main vertebral bodies (i.e., centra) are rich in cancellous bone and are often the sites of age-related compression bone fractures in humans14. Lumbar (i.e., lower back) vertebrae are the largest vertebrae, bear most of the body&#39;s weight, and are the most common site for vertebral fractures15,16. The mechanical properties of vertebral bodies can best be directly assessed using uniaxial compression testing methods since axial compression is the normal force load imposed on vertebral columns in vivo17. Compression of the vertebral bodies in vivo occurs as a result of muscle and ligament contractions, the force of gravity, and ground reaction forces18.
Ex vivo compression testing of small animal vertebra can be difficult due to their small size, irregular shape, and fragility. The shape of vertebral bodies can be estimated as a parallelogram with mild ventral tilt and slight cranial concavity17. This shape presents challenges for achieving uniaxial compression testing ex vivo because, without adequate preparation to the loading surface, compressive forces will be applied to only part of the loading surface, resulting in a &#34;local contact&#34;17,19. This can cause inconsistent results and premature failure19. This is not the case in vivo because the loading surface is surrounded by intervertebral discs at the vertebral joints, which allows the load to be distributed throughout the cranial end plate. The intervertebral disc-cranial end plate complex plays an important role in the application of force throughout the vertebral body and the biomechanics of fracture to the vertebral body14,20. While compression testing is not new to the field of biology, there are limitations in the current methods of mechanical testing of bones. These limitations include the lack of predictor models and simulations for bone mechanics, unique geometric spatial architecture, and even inherent sample-based biological variations21. More importantly, the field is challenged by a lack of standardization between methods and an overall lack of reported methods in the literature22.
There are two methods reported in the literature for the preparation of rodent lumbar vertebrae to achieve uniaxial compression testing: the cutting method and the embedding method17,19,23,24,25,26. The cutting method requires that the vertebral processes, cranial end plate, and caudal end plate are cut from the vertebral body. Pendleton et al.19 have previously reported a detailed method for the use of this method on mouse lumbar vertebrae. This method presents the challenges of achieving perfectly parallel cuts at both the caudal and cranial end plates while also avoiding any damage to the sample. It also has the limitation that the cranial end plate is removed. The cranial end plate contains a dense shell of cortical bone and plays an important role in distributing loads from the intervertebral discs in vivo and is involved in the failure of the bone for in vivo fractures17,20,27. In contrast, the embedding method involves removing the vertebral processes while keeping the cranial end plate of the vertebral body intact. The loading surface is then made approximately horizontal by placing a small amount of bone cement onto the cranial end of the vertebral body. This method has the advantage that it overcomes the technical challenges associated with the cutting method and may better mimic the mechanism of load application and bone failure in vivo due to the preservation of the cranial end plate. This approach has previously been documented in studies involving uniaxial compression testing on rat bones. However, as far as we are aware, it has not been previously documented in the context of smaller mouse lumbar vertebrae17,25,26. The method in question was previously detailed by Chachra et al.25 &#160; and originally used a bone specimen held in between two plates, each with a cylindrical cavity, which was then filled with polymethylmethacrylate (PMMA). The same research group later improved the method where one end is gently sanded (caudal), and the other end has a small spot of bone cement added (cranial)26. This method is an improvement on the previous method because it minimizes the material between the platens and is the focus of this article. Despite the challenges associated with uniaxial vertebral compression testing, it is a method that may provide valuable information regarding the effects of a proposed therapy on bone, especially when paired with three-point bending.
Here, the use of a convertible three-point bending/compression testing machine to allow for easy testing of both long bones and vertebral bodies using a single machine is presented. Furthermore, the use of an embedding method to achieve uniaxial compression testing of mouse lumbar vertebrae is presented. The present study was performed as part of a larger study that aimed to investigate the influences of dietary hempseed supplementation on the properties of skeletal bone in young, growing female C57BL/6 mice5,6. The three-point bending tester was originally constructed by faculty and students in the Engineering Dept. at Colorado State University-Pueblo and used by our research group in three-point bending tests on long bones [rat femur and tibia7 and mouse humerus, femur, and tibia5,6,8,9]. However, its modification and application for use in mouse vertebral body compression testing was&#160;not been explored. The design and construction of the three-point bending machine have been previously described7. This report will focus on methods used to modify the machine for compression testing and to correct for system displacement. Secondly, the embedding method for mouse vertebral body loading surface preparation is described, along with methods for uniaxial compression testing and the analysis of load-displacement data.

Autore in primo piano: Migliorare i test di compressione ossea per piccoli animali per la ricerca

Prova di compressione uniassiale della vertebra lombare del topo con inclusione della superficie di carico

Our research focuses on mechanical strength testing of small animal bones. Specifically, we aim to present an embedding method for compression testing of lumbar vertebrae. Applications for this research area include a better understanding of aging and dietary influences on vertebral bone mechanical properties.Inherently, the small size of the vertebra is a challenge for compression testing, but the embedding method improves accessibility because the main preparation is to remove only the vertebral processes from the main body, but leaving other structures intact. The small size of mouse vertebra makes them challenging to prepare for compression testing. Our method provides a simpler means of preparing the loading surface for uniaxial compression testing.Furthermore, we present the construction of compression testing machine from a three-point bending machine for easy conversion between the two. Our method allows researchers a simple means of pairing three-point bending and compression testing, which may allow researchers to better discern the effects of pharmacologic therapy, dietary intervention, or other treatments on a cortical-rich versus cancellous-rich bone in a rodent model. We are exploring compression testing for other types of biological specimens.For example, we are developing methods for testing mouse mandibles combined with other bone evaluation techniques. This will enable a more comprehensive approach to studying factors that influence bone properties, such as aging and diet.

Con questo protocollo passo-passo che utilizza l'incorporazione della superficie di carico L5 e una macchina di piegatura a tre punti convertibile/macchina per prove di compressione, è possibile eseguire test di compressione sulla vertebra lombare del topo per confronti intergruppo. Un totale di ventiquattro vertebre L5 di topo sono state preparate utilizzando il metodo di inclusione. Tre dei campioni, tuttavia, sono stati danneggiati durante la rimozione dei processi vertebrali utilizzando un disco da taglio diamantato su un utensile rotante e, quindi, non sono stati testati. Alla luce di ciò, le proprietà meccaniche elencate sono state ottenute con successo da ventuno dei ventiquattro campioni utilizzando il metodo di inclusione. I campioni sono stati ispezionati visivamente dopo ogni test e il tappo in PMMA non ha subito danni in nessuno dei test. Come notato, i topi utilizzati nel presente studio facevano parte di uno studio più ampio che mirava a determinare gli effetti dei semi di canapa dietetici sulle ossa di topi femmina C57BL/6 giovani e in crescita. Le statistiche descrittive di cinque proprietà meccaniche dell'osso intero comunemente riportate sono offerte nella Tabella 1. Le curve carico-spostamento per tutti i ventuno campioni sono fornite nella Figura 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65502/65502fig01.jpg"> Figura 1: La conversione di una piegatrice a tre punti in una macchina per prove di compressione. (A) La macchina è completamente attrezzata per funzionare come piegatrice a tre punti con il sensore di spostamento e il sensore di carico indicati (frecce bianche). (B) La macchina dopo che la traversa è stata rimossa. (C) La macchina dopo che una piastra superiore autoallineante è stata posizionata dove in precedenza era posizionata la trave della traversa. (D) Le travi di supporto inferiori con fori praticati in esse. (E) La piastra inferiore in acciaio inossidabile con quattro fori filettati filettati e una vite parzialmente avvitata in uno dei fori. Gli altri due fori che non si vedono nella foto sono sul lato opposto. (F) Le travi di supporto inferiori con la piastra inferiore fissata ad esse da quattro viti esagonali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65502/65502fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65502/65502fig02.jpg"> Figura 2: Un esempio di spostamento del sistema (macchina Δx) rispetto al grafico del carico dotato di una regressione lineare (A), logaritmica (B), polinomio del secondo ordine (C) e polinomio del terzo ordine (D). In questo esempio, il polinomio del terzo ordine fornisce l'adattamento migliore per ogni valore R2 e la relativa regressione viene utilizzata come fattore di correzione dello spostamento del sistema. Le immagini rappresentano dati di esempio per dimostrare l'adattamento della regressione e dovranno essere ottenute dai ricercatori per le singole macchine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65502/65502fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65502/65502fig03.jpg"> Figura 3: Colonna vertebrale lombare del topo. Una colonna vertebrale lombare di topo sotto un microscopio da dissezione prima che L6 fosse rimossa (A) e dopo che L6 fosse stata rimossa, lasciando L5 attaccato (B). L5 verrà successivamente rimosso e preparato per la prova di compressione. Le bande di colore bianco sono i dischi intervertebrali che sono stati sezionati e rimossi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65502/65502fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65502/65502fig04.jpg"> Figura 4: Anatomia della vertebra L5. Una vertebra L5 di topo rappresentativa nelle viste craniale, caudale, dorsale e ventrale sotto un microscopio da dissezione. Le dimensioni importanti per il corpo vertebrale includono l'altezza, la larghezza dorso-ventrale e la larghezza laterale, come mostrato dalle linee colorate. Le linee tratteggiate nere mostrano approssimativamente dove devono essere effettuati i tagli per rimuovere i processi vertebrali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65502/65502fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65502/65502fig05.jpg"> Figura 5: Periodo di indurimento del cemento osseo PMMA. Un esempio di vertebra L5 con cemento osseo in PMMA (verde) posizionato sulla placca terminale cranica e la piastra superiore abbassata sul complesso cemento osseo in PMMA + osso. Una volta che il cemento osseo PMMA si è completamente indurito, inizierà la prova di compressione. La piastra superiore verrà ulteriormente abbassata fino a quando non si osserva un guasto del materiale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65502/65502fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65502/65502fig06.jpg"> Figura 6: Curva carico-spostamento del test di compressione ossea vertebrale di topo e analisi dei dati. Il cursore A indica l'inizio del test di compressione. Il cursore B contrassegna il punto di rottura del materiale. Il cursore C segna l'inizio della regione elastica lineare, mentre il cursore D segna la fine (cioè il punto di snervamento). L'area ombreggiata in grigio chiaro è la regione elastica lineare, dove il materiale tornerà alla sua forma originale se il carico viene rimosso. L'area ombreggiata in grigio scuro è la regione plastica, dove il materiale ha subito una deformità permanente e non tornerà alla sua forma originale se il carico viene rimosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65502/65502fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65502/65502fig07.jpg"> Figura 7: Curve carico-spostamento per tutti i ventuno campioni ossei. I modelli variavano tra le ossa. In generale, la maggiore variabilità si è verificata nello spostamento post-cedimento, con alcune (n = 5) ossa che hanno uno spostamento post-rendimento relativamente piccolo e altre (n = 16) che hanno uno spostamento post-rendimento relativamente grande. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65502/65502fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Gruppo</td>
			<td>Lavoro a guasto (N*mm)</td>
			<td>Carico massimo (N)</td>
			<td>Rigidità (N/mm)</td>
			<td>Carico di snervamento (N)</td>
			<td>Spostamento post-snervamento (mm)</td>
		</tr><tr><td>CON (n = 7)</td>
			<td>13,43 ± 2,44 A,B</td>
			<td>37.93 ± 3.28</td>
			<td>109.14 ± 11.86</td>
			<td>22.68 ± 2.04</td>
			<td>0,34 ± 0,06</td>
		</tr><tr><td>5HS (n = 8)</td>
			<td>12,12 ± 1,23 A</td>
			<td>33,62 ± 2,43</td>
			<td>99.70 ± 16.62</td>
			<td>20.88 ± 2.69</td>
			<td>0,38 ± 0,08</td>
		</tr><tr><td>15HS (n = 6)</td>
			<td>19,55 ± 2,13 B</td>
			<td>41,82 ± 1,85</td>
			<td>134.58 ± 19.73</td>
			<td>28.07 ± 3.20</td>
			<td>0.51 ± 0.07</td>
		</tr><tr><td>Gruppi combinati (n = 21)</td>
			<td>14.68 ± 1.27</td>
			<td>37.40 ± 1.63</td>
			<td>121.82 ± 9.43</td>
			<td>23.54 ± 1.60</td>
			<td>0,40 ± 0,04</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Valori rappresentativi delle proprietà meccaniche dell'osso intero comunemente riportate, ottenuti utilizzando il metodo di inclusione della preparazione della superficie di carico. I valori sono stati ottenuti utilizzando tutti i protocolli descritti nel presente studio. Pertanto, i valori rappresentano quelli che possono essere ottenuti utilizzando i metodi qui descritti. I valori sono espressi ± SEM. I gruppi rappresentano topi femmina C57BL/6 alimentati con una dieta arricchita con semi di canapa interi a concentrazioni di 0% (CON), 50 g/kg (5%) (5HS) o 150 g/kg (15%) (15HS) di età compresa tra 5 e 29 settimane. Per uno dei parametri (work-to-failure), sembra che la dieta abbia influenzato i valori per un'ANOVA unidirezionale (p < 0,05). I valori che condividono lo stesso apice della lettera non sono significativamente diversi (p > 0,05), mentre i valori con apici di lettere diverse sono significativamente diversi (p < 0,05), secondo l'analisi post hoc di Tukey-Kramer.
File supplementare 1: Codice di esempio per ottenere le proprietà meccaniche dell'osso intero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65502/JOVE_Supplementary.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Small Animal Bone Compression Testing for Research at JoVE.com

In questo protocollo, vengono descritti due approcci per rendere più praticabili i test di compressione uniassiale delle vertebre lombari dei topi. Innanzitutto, viene descritta la conversione di una piegatrice a tre punti in una macchina per prove di compressione. In secondo luogo, un metodo di inclusione per preparare la superficie di carico che utilizza cemento osseo è adattato per le vertebre lombari dei topi.

There is increasing awareness that cortical and cancellous bone differ in regulating and responding to pharmaceutical therapies, hormone therapies, and ...

La nostra ricerca si concentra sui test di resistenza meccanica di ossa di piccoli animali. In particolare, ci proponiamo di presentare un metodo di inclusione per i test di compressione delle vertebre lombari. Le applicazioni per quest'area di ricerca includono una migliore comprensione dell'invecchiamento e delle influenze dietetiche sulle proprietà meccaniche dell'osso vertebrale.Di per sé, le piccole dimensioni della vertebra rappresentano una sfida per i test di compressione, ma il metodo di inclusione migliora l'accessibilità perché la preparazione principale consiste nel rimuovere solo i processi vertebrali dal corpo principale, ma lasciando intatte le altre strutture. Le piccole dimensioni delle vertebre del topo le rendono difficili da preparare per i test di compressione. Il nostro metodo fornisce un mezzo più semplice per preparare la superficie di carico per le prove di compressione uniassiale.Inoltre, presentiamo la costruzione di una macchina per prove di compressione da una piegatrice a tre punti per una facile conversione tra i due. Il nostro metodo consente ai ricercatori un mezzo semplice per accoppiare i test di flessione e compressione a tre punti, che possono consentire ai ricercatori di discernere meglio gli effetti della terapia farmacologica, dell'intervento dietetico o di altri trattamenti su un osso ricco di corticali rispetto a quello ricco di spongiosi in un modello di roditore. Stiamo esplorando i test di compressione per altri tipi di campioni biologici.Ad esempio, stiamo sviluppando metodi per testare le mandibole di topo combinati con altre tecniche di valutazione ossea. Ciò consentirà un approccio più completo allo studio dei fattori che influenzano le proprietà ossee, come l'invecchiamento e la dieta.

mouse-lumbar-vertebra-uniaxial-compression-testing-with-embedding

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Lumbar Vertebra Uniaxial Compression Testing with Embedding of the Loading Surface

965 Views.  Colorado State University-Pueblo. La nostra ricerca si concentra sui test di resistenza meccanica di ossa di piccoli animali. In particolare, ci proponiamo di presentare un metodo di inclusione per i test di compressione delle vertebre lombari. Le applicazioni per quest'area di ricerca includono una migliore comprensione dell'invecchiamento e delle influenze dietetiche sulle proprietà meccaniche dell'osso vertebrale.Di per sé, le piccole dimensioni della vertebra rappresentano una sfida per i test di compressione, ma...

Video: Autore in primo piano: Migliorare i test di compressione ossea per piccoli animali per la ricerca

There is increasing awareness that cortical and cancellous bone differ in regulating and responding to pharmaceutical therapies, hormone therapies, and other treatments for age-related bone loss. Three-point bending is a common method used to assess the influence of a treatment on the mid-diaphysis region of long bones, which is rich in cortical bone. Uniaxial compression testing of mouse vertebrae, though capable of assessing bones rich in cancellous bone, is less commonly performed due to technical challenges. Even less commonly performed is the pairing of three-point bending and compression testing to determine how a treatment may influence a long bone's mid-diaphysis region and a vertebral centrum similarly or differently. Here, we describe two procedures to make compression testing of mouse lumbar vertebrae a less challenging method to perform in parallel with three-point bending: first, a procedure to convert a three-point bending machine into a compression testing machine, and second, an embedding method for preparing a mouse lumbar vertebra loading surface.

In this protocol, two approaches are described to make uniaxial compression testing of mouse lumbar vertebrae more attainable. First, the conversion of a three-point bending machine to a compression testing machine is described. Second, an embedding method for preparing the loading surface that uses bone cement is adapted for mouse lumbar vertebrae.

Ricerca

Biologia

Conversion of a Three-Point Bending Machine to a Compression Testing Machine

To begin unscrew the crosshead beam attached to the load sensor on the three-point bending machine. Screw a self-aligning top platin onto the load sensor with threading identical to the crosshead beam. Turn on the machine at a constant lowering speed to begin compression testing.Using the threaded hex screws, secure the bottom platin to the two lower supports, and tighten them until they are securely fastened. Then to determine machine displacement, lower the top platin onto the bottom platin, until light contact is made with no test material in between. Use digital data collection software to collect load and displacement measurements during the mechanical testing.Continue lowering the top platin onto the bottom platin at a constant speed until forces greater than that produced by all bone samples are reached. Plot the data for system displacement versus applied load, correct the recorded displacement for each data point from mouse vertebra samples obtained in subsequent steps.

Conversione di una piegatrice a tre punti in una macchina per prove di compressione

Dissection of the 5th Lumbar Vertebra (L5) from the Mouse Carcass for Uniaxial Compression Testing

To begin, make a small incision on the dorsal midline of the mouse carcass near the base of the tail. Extend the incision across each hind limb and gently pull to remove the pelt from the base of the tail toward the head of the animal. Cut the abdominal wall musculature away until the vertebral column becomes easily visible.Under a dissecting microscope, identify the two sacroiliac joints and locate the cranial end of the sacrum. Using a razor blade or scalpel, make a precise cut to separate the last lumbar vertebrae from the cranial end of the sacrum. Again, cut between the intervertebral space.Remove L six and L five from the vertebral column and set aside L five for analysis. Inspect the vertebra under a dissecting microscope and remove all soft tissues from the bone, including the intervertebral disc using gauze pads and gently with forceps where necessary.

Dissezione della 5a vertebra lombare (L5) dalla carcassa del topo per test di compressione uniassiale

Preparing L5 Vertebra Loading Surface for Uniaxial Compression Testing Using the PMMA Bone Cement Embedding Method

To begin, dissect the fifth lumbar vertebra isolated from the frozen mouse carcass. Using a diamond cutoff wheel attached to a rotary tool, cut each pedicle to remove the transverse and spinous processes. Gently sand the coddle end of the vertebrae using fine 120-grit sandpaper to eliminate all intervertebral discs, soft tissue, and irregularities.Then mark the sanded coddle end with a permanent marker for easy identification later. Prepare the PMMA bone cement according to the manufacturer's instructions. Apply a small amount of the semi-soft PMMA bone cement onto the upper side of the unmarked cranial end of the vertebra and rehydrate with saline.While the PMMA is still semi-soft, position the vertebra on the bottom platin with the coddle side facing downwards. Now turn on the machine to engage the drive gears and gradually lower the top platin onto the vertebra and PMMA bone cement complex until it contacts the bone cement. Allow the PMMA bone cement to completely harden while the top platin gently presses down on it.In real time, use digital software designed for data collection of mechanical testing to collect data for load and displacement from the sensors into a spreadsheet. After collecting baseline data for five seconds, applied with a minimal preload force of less than 0.5 newtons. Gradually lower the top platin onto the sample at a constant and predetermined lowering speed, to initiate the compression test.Cease data collection, once a significant reduction in load has been observed indicating material failure. Correct each data point for system displacement, using the equation obtained in previous steps. To create a load displacement curve with the load on the Y axis and the corrected specimen displacement on the X axis.First, create a table by clicking on windows, then selecting new table, followed by do it"Copy the corrected displacement and load data from the raw data spreadsheet into the new table. Then to generate a waveform representing the raw data, click data and select XY pair to waveform. Select corrected displacement data for the X wave and load data for the Y wave, ensure the correct data points are in the number of points box.Name the wave form, and click make wave form. After creating the wave form, visualize the load displacement curve by clicking on windows and selecting new graph. Place the waveform on the Y axis and calculate it on the X axis to generate a graph.Use the cursor tool to mark points or regions of interest on the graph for further analysis.

Preparazione della superficie di carico vertebrale L5 per la prova di compressione uniassiale utilizzando il metodo di inclusione del cemento osseo PMMA