Questa ricerca è stata supportata dal Main Research Program (E0210702-03) del Korea Food Research Institute (KFRI), finanziato dal Ministero della Scienza e delle TIC.

1. Preparazione dell'inoculo batterico
<ol><li>Rimuovere il flaconcino di glicerolo conservato a -80 °C.</li>
	<li>Rimuovere il ceppo batterico (2-10 μL) dal flaconcino utilizzando un puntale sterile per pipetta. NOTA: In questo protocollo vengono utilizzati ceppi di Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1). </li>
	<li>Inoculare una piastra di agar di sangue disponibile in commercio (agar di soia triptica integrato con il 5% di sangue di pecora, vedere Tabella dei materiali) con i batteri. NOTA: È possibile utilizzare anche altri terreni, come l'agar nutriente o l'agar MacConkey.</li>
	<li>Striare la superficie dell'agar utilizzando un anello sterile con fiamma intermittente per diluirla.</li>
	<li>Porre la piastra di agar capovolta in un'incubatrice e incubare a 30 °C per una notte per 20-24 ore.</li>
	<li>Prelevare una singola colonia della coltura batterica con un ago sterile e inoculare 5 mL di brodo sterile per infusione di cuore cerebrale (BHI, vedere Tabella dei materiali) con la coltura.</li>
	<li>Incubare il brodo inoculato in un'incubatrice agitata a 30 °C per una notte per 20-24 ore a circa 150 giri/min.</li>
	<li>Trasferire 1 mL di coltura notturna in una provetta sterile per microcentrifuga e centrifugare la coltura durante la notte a 6.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
	<li>Utilizzando un vortice, risospendere il pellet in 1 mL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Centrifugare a 6.000 × g per 10 minuti a RT e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in BHI sterile diluito dieci volte utilizzando il vortice a una densità ottica di circa 0,1 a 600 nm. NOTA: La densità ottica di circa 0,1 è equivalente a circa 10,7 CFU/mL.</li>
</ol>2. Quantificazione del biofilm mediante crystal violet
<ol><li>Aggiungere 200 μL di inoculo a ciascun pozzetto di una piastra sterile in polistirene a 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere 200 μL di acqua deionizzata a ciascuno dei pozzetti più esterni per evitare che i pozzetti interni si secchino15.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di BHI diluito dieci volte a ciascun pozzetto della stessa piastra come controllo negativo.</li>
	<li>Incubare la piastra a 25 °C per 24 ore.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta. NOTA: La pipetta multicanale è spesso più conveniente per più campioni.</li>
	<li>Aggiungere con cautela 300 μL di PBS a ciascun pozzetto e rimuovere il surnatante con una pipetta. NOTA: La pipetta multicanale è spesso più conveniente per più campioni.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.5 altre due volte.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di soluzione di cristallo violetto (1%) (vedere Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto e incubare a RT per 30 minuti.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.4-2.6.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di etanolo assoluto a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a RT. Miscelare accuratamente pipettando su e giù più volte.</li>
	<li>Trasferire l'eluizione da 100 μL da ciascun pozzetto a una nuova piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 595 nm utilizzando un lettore per micropiastre (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Quando l'assorbanza supera 2,0, effettuare una corretta diluizione del campione all'assorbanza inferiore a 2,0 in etanolo assoluto e misurarla come al punto 2.11. Quindi, calcolare l'assorbanza del campione (valore finale) moltiplicando il valore osservato per il fattore di diluizione.</li>
	<li>Calcolare l'assorbanza reale dei campioni sottraendo il valore medio del controllo negativo dal valore di ciascun pozzetto dei campioni di prova sulla stessa piastra di pozzetto.</li>
</ol>3. Conteggio della vitalità del biofilm
<ol><li>Aggiungere 1 mL di inoculo (fase 1) a ciascun pozzetto di una piastra sterile in polistirene a 12 pozzetti15. Incubare la piastra a 25 °C per 24 ore. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere con cautela 1,5 mL di PBS sterile a ciascun pozzetto e rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di PBS sterile a ciascun pozzetto.</li>
	<li>Raschiare via le superfici del fondo e delle pareti del pozzo utilizzando raschietti per celle montati.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare raccolta in una provetta di plastica sterile (10-1) contenente 9 mL di soluzione fisiologica (0,85% NaCl) e 10-20 perle di vetro (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Per raccogliere eventuali detriti residui di biofilm lasciati sulla superficie inferiore del pozzo, è possibile risospenderlo e trasferirlo tramite pipetta utilizzando soluzione fisiologica dalla provetta 10-1 .</li>
	<li>Vorticare il tubo 10-1 per 60 s alla massima velocità.</li>
	<li>Effettuare una diluizione seriale di 10 volte trasferendo 1 mL nella provetta sterile successiva (10-2) contenente 9 mL di soluzione fisiologica (0,85 % NaCl) fino a 10-7.</li>
	<li>Distribuire 100 μL da ciascuna diluizione su Acinetobacter agar (vedere Tabella dei materiali) e incubare le piastre di agar a 30 °C per 24-42 h.</li>
	<li>Contare manualmente il numero delle tipiche colonie rosse su ogni piatto nell'intervallo compreso tra 10 e 250.</li>
	<li>Calcola il numero di cellule vitali nel biofilm di ciascun pozzetto utilizzando l'equazione seguente: Cellule vitali = Numero di colonie × Fattori di diluizione × 10</li>
</ol>4. Visualizzazione del biofilm mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM)
<ol><li>Aggiungere 200 μL di inoculo a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti destinata all'analisi microscopica.</li>
	<li>Incubare la piastra a 25 °C per 24 ore.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere con cautela 300 μL di acqua deionizzata sterilizzata con filtro a ciascun pozzetto e rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.4.</li>
	<li>Preparare la miscela di SYTO 9 e ioduro di propidio (vedere Tabella dei materiali) diluita in acqua deionizzata sterilizzata con filtro fino a una concentrazione finale di 10 μM e 60 μM, rispettivamente.</li>
	<li>Aggiungere la miscela a ciascun pozzetto a 200 μL e incubare la piastra per 20-30 minuti a RT al buio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.3-4.4</li>
	<li>Visualizzare i biofilm attaccati alla superficie inferiore utilizzando CLSM con la lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e 561 nm e l'intervallo di lunghezze d'onda di emissione di 499-535 nm e 568-712 nm, rispettivamente.</li>
</ol>

Valutazione della formazione di biofilm da Acinetobacter e caratterizzazione dei biofilm

<ol>
	<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections:+a+century+of+challenges.">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li><li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review.">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675 (2021).</li><li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter:+an+old+friend,+but+a+new+enemy.">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li><li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens:+Norovirus,+Clostridium+difficile,+and+Acinetobacter+species.">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix:+multitasking+in+a+shared+space.">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+microbial+&amp;#34;protective+clothing&amp;#34;+in+extreme+environments.">Biofilms: the microbial &amp;#34;protective clothing&amp;#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).</li><li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis:+a+review.">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li><li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii.">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li><li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells.">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714 (2022).</li><li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii:+genotype-phenotype+correlation.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849 (2019).</li><li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates.">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630 (2020).</li><li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157:H7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes.">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125 (2023).</li><li>Stepanovi&#263;, S., &#262;irkovi&#263;, I., Ranin, L., Svabi&#263;-Vlahovi&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface.">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li><li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville,+Tennessee.">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).</li><li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-attached+cells,+biofilms+and+biocide+susceptibility:+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection.">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li><li>Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment.">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).</li><li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157:H7.">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li><li>McConnell, M. J., Actis, L., Pach&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+human+infections,+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models.">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li><li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilms:+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties.">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Utilizzando il protocollo descritto, è stata misurata, visualizzata la formazione di biofilm di isolati di Acinetobacter con vari gradi e sono state stimate le cellule vitali nei biofilm (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
In questo protocollo sono state utilizzate due diverse temperature, 30 °C per la crescita e 25 °C per la formazione del biofilm di Acinetobacter. È stata utilizzata u...

È noto che l'Acinetobacter causa infezioni nosocomiali e la sua infezione umana, soprattutto nelle strutture sanitarie, è sempre più segnalata1. È diffuso negli ospedali, nelle strutture sanitarie e negli ambienti associati al cibo 2,3,4. Può sopravvivere per un lungo periodo in ambienti come le superfici ospedaliere come le sponde dei letti, i comodini, la superficie dei ventilatori e i lavandini4. Tale persistenza sulle superfici ambientali può essere uno dei fattori significativi che contribuiscono alle infezioni nosocomiali di Acinetobacter4.
Il biofilm è una forma di vita microbica ed è una matrice microbica composta da cellule microbiche vive e sostanze polimeriche extracellulari (EPS) provenienti dalle cellule5. Le cellule microbiche sono incorporate nella matrice e sono spesso altamente resistenti agli stress ambientali come calore, sali, secchezza, antibiotici, disinfettanti e forze di taglio 6,7.
L'Acinetobacter può formare biofilm sulle superfici, suggerendo che può contribuire a prolungare la sopravvivenza sulle superfici ambientali, comprese le superfici ospedaliere, e a migliorare la resistenza al trattamento antibiotico 8,9. Inoltre, la formazione di biofilm di Acinetobacter potrebbe essere altamente associata agli esiti clinici nell'uomo8. Pertanto, la formabilità del biofilm dei ceppi di Acinetobacter potrebbe essere uno degli indicatori nel predire la sopravvivenza ambientale e le infezioni umane 8,10.
I biofilm attaccati alla superficie possono essere quantificati e visualizzati per valutare la formabilità del biofilm. Per quantificare i biofilm attaccati alla superficie, i biofilm vengono normalmente colorati con coloranti coloranti per biofilm come il crystal violet e i coloranti vengono eluiti in soluzione e misurati per la densità ottica11. La visualizzazione dei biofilm è un altro buon approccio per valutare la formabilità del biofilm11. Il metodo di visualizzazione della microscopia laser a scansione confocale (CLSM) che impiega la specificità utilizzando coloranti fluorescenti potrebbe essere più utile per caratterizzare la morfologia del biofilm rispetto ad altre tecniche come SEM12,13.
Le cellule vitali nei biofilm possono essere contate per stimare il numero di cellule vitali nei biofilm11. Le cellule vitali incorporate nei biofilm vengono staccate, diluite, distribuite su piastre di agar, incubate ed enumerate. Poiché è probabile che il numero maggiore di cellule soddisfi la dose infettiva, può fornire informazioni più dettagliate sui biofilm, come i potenziali di infezione associati al numero di cellule13,14.
Questo articolo presenta protocolli passo-passo per (1) quantificare i biofilm attaccati alla superficie, (2) contare le cellule vitali nei biofilm e (3) visualizzare i biofilm utilizzando il CLSM di Acinetobacter. I protocolli presentati descrivono i metodi per valutare la formabilità del biofilm degli isolati di Acinetobacter e caratterizzare i loro biofilm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td>Polystyrene 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1.10493.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar Base Plate</td>
			<td>KisanBio</td>
			<td>MB-B1005-P50</td>
			<td>Growth media for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Acinetobacter</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>AC092</td>
			<td>Selective plate for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V5265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10316</td>
			<td>SYTO9 and propidium iodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td>
			<td>Biofilm measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Glass Plating Beads</td>
			<td>RBC</td>
			<td>RG001</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>89621</td>
			<td>Microplate intended for CLSM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification, viability assessment, and visualization strategies for acinetobacter biofilms

L'Acinetobacter provoca infezioni nosocomiali e la sua formazione di biofilm può contribuire alla sopravvivenza su superfici asciutte come gli ambienti ospedalieri. Pertanto, la quantificazione e la visualizzazione del biofilm sono metodi importanti per valutare il potenziale dei ceppi di Acinetobacter di causare infezioni nosocomiali. I biofilm che si formano sulla superficie della micropiastra possono essere quantificati in termini di volume e numero di cellule. I volumi del biofilm possono essere quantificati mediante colorazione con crystal violet, lavaggio, decolorazione con etanolo, quindi misurazione del colorante solubilizzato con un lettore di micropiastre. Per quantificare il numero di cellule incorporate nei biofilm, i biofilm vengono raschiati utilizzando raschietti cellulari, raccolti nella soluzione salina, agitati vigorosamente in presenza di perle di vetro e sparsi su Acinetobacter agar. Successivamente, le piastre vengono incubate a 30 °C per 24-42 ore. Dopo l'incubazione, le colonie rosse vengono enumerate per stimare il numero di cellule nei biofilm. Questo metodo di conteggio può essere utile anche per contare le cellule di Acinetobacter nei biofilm di specie miste. I biofilm di Acinetobacter possono essere visualizzati utilizzando coloranti fluorescenti. Una micropiastra disponibile in commercio progettata per l'analisi microscopica viene impiegata per formare biofilm. Quindi, i biofilm attaccati alla superficie inferiore vengono colorati con SYTO9 e coloranti allo ioduro di propidio, lavati, quindi visualizzati con microscopia a scansione laser confocale.

Acinetobacter is known to cause nosocomial infections, and its human infection, especially in healthcare facilities, is increasingly reported1. It is widespread in hospitals, healthcare facilities, and food-associated environments2,3,4. It can survive for a long period in environments including hospital surfaces such as bed rails, bedside tables, the surface of ventilators, and sinks4. Such persistence on environmental surfaces may be one of the significant factors contributing to the nosocomial infections of Acinetobacter4.
Biofilm is a form of microbial life and is a microbial matrix composed of live microbial cells and extracellular polymeric substances (EPS) from the cells5. The microbial cells are embedded in the matrix and are often highly resistant to environmental stresses such as heat, salts, dryness, antibiotics, disinfectants, and shear forces6,7.
Acinetobacter can form biofilms on surfaces, suggesting that it may contribute to extended survival on environmental surfaces, including hospital surfaces, and enhanced resistance to antibiotic treatment8,9. In addition, the biofilm formation of Acinetobacter could be highly associated with human clinical outcomes8. Therefore, the biofilm formability of Acinetobacter strains could be one of the indicators in predicting environmental survival and human infections8,10.
The surface-attached biofilms can be quantified and visualized to assess biofilm formability. To quantify surface-attached biofilms, the biofilms are normally stained by biofilm-staining dyes such as crystal violet, and the dyes are eluted in solution and measured for optical density11. Visualization of biofilms is another good approach to assess biofilm formability11. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) visualization method employing specificity using fluorescent dyes could be more useful to characterize biofilm morphology compared to other techniques such as SEM12,13.
The viable cells in biofilms can be counted to estimate the number of viable cells in biofilms11. The viable cells embedded in biofilms are detached, diluted, spread on agar plates, incubated, and enumerated. Because the higher number of cells is likely to meet the infectious dose, it can provide more detailed information on biofilms, such as infection potentials associated with the number of cells13,14.
This article presents step-by-step protocols to (1) quantify surface-attached biofilms, (2) count viable cells in the biofilms, and (3) visualize the biofilms using CLSM of Acinetobacter. The presented protocols describe the methods to assess the biofilm formability of Acinetobacter isolates and characterize their biofilms.

Autore in primo piano: un protocollo completo per la quantificazione, la valutazione e la visualizzazione del biofilm di Acinetobacter 

Strategie di quantificazione, valutazione della vitalità e visualizzazione per biofilm di Acinetobacter

Biofilms are composed of live microbial cells and are difficult to remove from the surfaces. Acinetobacter strains commonly found in our environment, causing nosocomial infections, are also known to form biofilms on surfaces. So, we aim to develop methods to both quantify and visualize Acinetobacter biofilms.Our protocol provides a simple and easy method to quantify and visualize the biofilms of Acinetobacter. The viable number of cells inside the biofilms is quantified by using the viable count method. Our research findings reveal that the naturally-existing Acinetobacter vector strains have quite varying potentials for biofilm formation.Also, there will exist distinct morphological differences within the various biofilms. This paved the way for research focusing on the causes of such a large variation among Acinetobacter strains.

Seguendo il protocollo, i biofilm di isolati di Acinetobacter, originariamente isolati dalle superfici delle cucine, sono stati formati su una piastra di polistirene a 96 pozzetti, colorata con crystal violet, e i coloranti sono stati solubilizzati in etanolo e misurati per la massa del biofilm (Figura 1). Il numero di biofilm variava notevolmente a seconda dei ceppi che variavano da OD 0,04 a 1,69 (Figura 1). Sulla base dei criteri stabiliti da Stepano...

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Questo protocollo descrive la preparazione dell'inoculo, la quantificazione del biofilm su piastre per microtitolazione utilizzando un colorante crystal violet, la conta vitale nei biofilm e la visualizzazione dei biofilm di Acinetobacter.

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

I biofilm sono composti da cellule microbiche vive e sono difficili da rimuovere dalle superfici. I ceppi di Acinetobacter che si trovano comunemente nel nostro ambiente, causando infezioni nosocomiali, sono anche noti per formare biofilm sulle superfici. Pertanto, miriamo a sviluppare metodi per quantificare e visualizzare i biofilm di Acinetobacter.Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice e facile per quantificare e visualizzare i biofilm di Acinetobacter. Il numero vitale di cellule all'interno dei biofilm viene quantificato utilizzando il metodo del conteggio vitale. I risultati della nostra ricerca rivelano che i ceppi vettori di Acinetobacter esistenti in natura hanno un potenziale molto variabile per la formazione di biofilm.Inoltre, esisteranno differenze morfologiche distinte all'interno dei vari biofilm. Ciò ha aperto la strada alla ricerca incentrata sulle cause di una variazione così ampia tra i ceppi di Acinetobacter.

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

1.4K Views.  Korea Food Research Institute. I biofilm sono composti da cellule microbiche vive e sono difficili da rimuovere dalle superfici. I ceppi di Acinetobacter che si trovano comunemente nel nostro ambiente, causando infezioni nosocomiali, sono anche noti per formare biofilm sulle superfici. Pertanto, miriamo a sviluppare metodi per quantificare e visualizzare i biofilm di Acinetobacter.Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice e facile per quantificare e visualizzare i biofilm di Acinetobacter. Il numero vitale di...

Video: Autore in primo piano: un protocollo completo per la quantificazione, la valutazione e la visualizzazione del biofilm di Acinetobacter 

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

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Biologia

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation  

To begin the process of bacterial inoculum preparation, collect 2 to 10 microliters of the bacterial strain from the vial, using a sterile pipette tip, and inoculate a commercially-available blood agar plate with it. Using a sterile loop, streak the agar surface, thinning it out with intermittent flaming. Incubate the prepared agar plate in an upside-down position at 30 degrees Celsius for about 20 to 24 hours.Next, select a single colony of the bacterial culture with a sterile needle and inoculate five milliliters of sterile BHI broth with this culture. Incubate the inoculated broth in a shaking incubator at 30 degrees Celsius at a speed of 150 rotations per minute for about 20 to 24 hours. Then transfer one milliliter of the culture to a sterile micro-centrifuge tube and centrifuge at 6, 000 g and room temperature for 10 minutes.Following centrifugation, discard the supernatant. Add one milliliter of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, to the pellet, and re-suspend it using a vortex. Centrifuge the re-suspended pellet at 6, 000 g for 10 minutes at room temperature and discard the supernatant.This time re-suspend the resulting pellet in sterile, tenfold-diluted BHI broth using vortex. Ensure to achieve an optical density of around 0.1 at 600 nanometers.

Preparazione dell'inoculo batterico per la formazione del biofilm di Acinetobacter

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet  

To begin, add 200 microliters of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 96-well plate. Then add 200 microliters of deionized water into the outermost wells to keep the inner wells from drying out. Incubate the 96-well plate at 25 degrees Celsius for 24 hours.Following incubation, discard the supernatant in each well using a pipette. Carefully add 300 microliters of PBS to each well and remove the PBS again by using the pipette. Add 200 microliters of 1%crystal violet solution to each well before incubating the plate at room temperature for 30 minutes.Then after dispensing 200 microliters of absolute ethanol in each well, leave the plate for 15 minutes at room temperature. Ensure thorough mixing by pipetting the contents in each well up and down repeatedly. Using a microplate reader, measure the absorbance of the wells at 595 nanometers to determine the biofilm mass.The number of biofilms varied greatly depending on the strains, ranging from an optical density or OD value of 0.04 to 1.69 All of the Acetobacter isolates, except for A.bouvetii, formed biofilms, while A.radioresistens formed a weak biofilm. A.junii and A.baumannii formed moderate biofilms, and A.pittii and A.ursingii formed strong biofilms.

Acinetobacter Quantificazione del biofilm utilizzando il viola cristallo

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count  

Begin by adding one milliliter of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 12 well plate. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours. Then, remove the supernatant using a pipette.Carefully add 1.5 milliliters of sterile phosphate buffered saline or PBS to each well, and again, remove the supernatant with the pipette. After adding one milliliter of sterile PBS to each well once more, use fitted cell scrapers to scrape off the bottom and wall surfaces of the wells. Transfer the harvested cell suspension to a sterile plastic tube marked as 10 to the negative one containing nine milliliters of saline and 10 to 20 glass beads.Vortex the tube for 60 seconds at maximum speed. Next, perform a tenfold serial dilution by transferring one milliliter of the cell suspension from the previous tube to another sterile tube marked 10 to the negative two containing nine milliliters of saline solution. Continue this process of serial dilution up to tube 10 to the negative seven.Spread 100 microliters from each dilution onto separate acinetobacter agar plates. Incubate the agar plates at 30 degrees Celsius for 24 to 42 hours. Then count the number of typical red colonies on each plate manually, considering those within the range between 10 and 250.All the acinetobacter isolates except for A.bouvetii had cells equivalent to seven to eight log CFU per well in their biofilms. While A.bouvetii had a much lower cell number at 4.4 Log CFU.

Valutazione della vitalità del biofilm di Acinetobacter

Acinetobacter Biofilm Visualization by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Begin by adding 200 microliters of bacterial inoculum into each well of a sterile 96-well plate prepared for microscopic analysis. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours before removing the supernatant with the pipette. Next, carefully add 300 microliters of filter-sterilized deionized water into each well.Remove the supernatant using a pipette once again. In another tube, prepare a diluted mixture of SYTO 9 and propidium iodide and filter-sterilized deionized water to the respective desired final concentrations. Then add 200 microliters of the mixture into each well and incubate the plate for 20 to 30 minutes at room temperature in a dark setting.Confocal laser scanning microscopy revealed that biofilm formation significantly varied depending on the strains. A substantial amount of biofilm was found in Acinetobacter junii, Acinetobacter baumannii, and Acinetobacter ursingii with distinct biofilm morphologies.