Questo protocollo fornisce una tecnica rigorosa e riproducibile per l'estrazione e l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da campioni di tessuto intero per analisi ex-vivo a valle. Con tra i più alti livelli di purezza attualmente raggiungibili, questo metodo facilita la caratterizzazione morfologica diretta, immunofenotipica e profonda delle vescicole interstiziali secrete in vari campioni di tessuto, compresi i tumori. Qui, dimostriamo l'isolamento dei veicoli elettrici tissutali dagli esemplari di tumore al cervello e ai polmoni.
Tuttavia, questa tecnica può essere applicata anche a studi che utilizzano diversi, benigni o altri campioni di tumore. Per iniziare, preparare 10 millilitri di tampone di dissociazione nel mezzo Hibernate-E per ogni 0,4-1,0 grammi di tessuto. Aggiungere il tessuto intero fresco o congelato al tampone in un tubo da 50 millilitri e incubare in un bagno d'acqua calda a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Dopo questo, aggiungere proteasi e inibitori della fosfatasi per una concentrazione finale di 1x nel tampone di dissociazione. Versare la soluzione con il tessuto in un omogeneizzatore di fit down sciolti. Utilizzare circa 30 colpi lenti per campione per dissociare delicatamente il tessuto.
Quindi, trasferire il tessuto dissociato e la soluzione tampone in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifuga a 500x g e a quattro gradi celsius per cinque minuti per pellettare le cellule e le fibre rimanenti o frammenti di tessuto coesivi. Trasferire il supernatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri e centrifugare a 2.000x g e a quattro gradi celsius per 10 minuti per pellet e scartare i grandi detriti cellulari.
Trasferire questo supernatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri e centrifugare a 10,000x g e a quattro gradi celsius per 40 minuti per pellettare eventuali vescicole più grandi indesiderate o piccoli corpi apoptotici. Decantare il supernatante attraverso un filtro da 0,45 micrometri in un tubo di ultracentrifugazione pulito da 12 millilitri. Successivamente, ultracentrifugare il campione a 100,000x g e a quattro gradi celsius per due ore, per pellet piccoli veicoli elettrici.
Decantare il supernatante e lasciare i tubi di ultracentrifugazione invertiti per cinque-10 minuti, toccando frequentemente per rimuovere qualsiasi liquido residuo ai lati dei tubi. Quindi, resostigliere il pellet EV in 1,5 millilitri di tampone di saccarosio molare 0,25. Coprire i tubi con Parafilm, quindi vortice i veicoli elettrici in soluzione.
Dondolare i tubi ultracentrifugo per 10-15 minuti a temperatura ambiente. E poi il vortice ancora una volta. Centrifugare brevemente i tubi a una velocità inferiore a 1.000x g per recuperare la sospensione liquida nella parte inferiore del tubo.
Se necessario, conservare la sospensione a quattro gradi Celsius durante la notte. In primo luogo, aggiungere 1,5 millilitri di iodixanolo al 60%iodixanolo agli 1,5 millilitri del tris tampone di saccarosio che contiene i veicoli elettrici per creare una soluzione finale contenente il 30%iodixanolo. Pipetta su e giù più volte per mescolare accuratamente la soluzione.
Trasferire questa soluzione sul fondo di un tubo di ultracentrifugazione da 5,5 millilitri. Quindi, mescolare lo stock di iodixanolo al 60% con acqua ultra pura per preparare almeno 1,5 millilitri sia di una soluzione del 20% che di uno iodixanolo al 10%. Utilizzando una siringa e un ago calibro 18, misurare 1,3 millilitri della soluzione di iodixanolo al 20% e stratificarlo con cura sopra il gradiente inferiore.
Tenere la smussatura dell'ago a contatto con l'interno del tubo, appena sopra il menisco e aggiungere la soluzione per evitare di mescolare gli strati all'interfaccia di densità. Quindi, strato 1,2 millilitri della soluzione di iodixanolo al 10% sopra lo strato del 20%, utilizzando la stessa tecnica. Bilanciare e caricare con cura i tubi di ultracentrifugazione in benne del rotore.
Impostare le velocità di accelerazione e decelerazione di un rotore a benna oscillante alle velocità minime e centrifugare a 268,000x g e a quattro gradi celsius per 50 minuti. Durante la centrifugazione del campione, etichettare 10 tubi di microcentrifugo da 10 1,5 millilitri per ogni campione che corrisponderanno con frazioni da uno a 10 del gradiente di densità. Una volta completata la centrifugazione, rimuovere delicatamente i tubi dalle benne del rotore e posizionarli in un supporto stabile.
Pipetta 10 frazioni seriali di 490 microlitri dalla parte superiore del gradiente nei tubi corrispondenti. Utilizzando un rifrattametro, misurare gli indici di rifrazione delle frazioni. Quindi, trasferire ogni frazione in un tubo di ultracentrifugazione pulito da 12 millilitri.
Aggiungere cinque millilitri di 1x PBS a ciascun tubo e pipetta su e giù lentamente per mescolare. Aggiungere altri sei millilitri di 1x PBS alla parte superiore del tubo e mescolare accuratamente di nuovo. Ultracentrifugare i tubi a 100.000x g e a quattro gradi celsius per ri-pellettizzare le piccole vescicole.
Decantare il supernatante e toccare i tubi asciutti prima di leccare le vescicole per l'analisi proteica o di rimescolare i veicoli elettrici per l'analisi morfologica. Per lisciviare i veicoli elettrici per l'analisi proteica, aggiungere 40 microlitri di tampone di lisi forte contenente inibitore della proteasi ai pellet EV. Posizionare Parafilm su ogni tubo e vortice vigorosamente.
Successivamente, dondolare di nuovo i tubi per 20 minuti a temperatura ambiente e vortice. Centrifugare brevemente il campione a 1.000x g per 30-60 secondi per recuperare l'intero volume del campione. Trasferire ogni campione in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e conservarlo a una temperatura compresa tra 20 e 80 gradi celsius fino a quando non è pronto per un'ulteriore lavorazione.
Per preparare i lysati purificati per l'analisi immunoblot, aggiungere 5x Tampone campione di Laemmli ai campioni per una concentrazione finale di 1x. Far bollire il campione a 95 gradi celsius per cinque-10 minuti. Quindi, caricare un volume uguale di frazioni da una a 10 in un gel di pagina 10%SDS.
Caricare una massa uguale di omogeneato tissutale. Eseguire l'elettroforesi e l'analisi western della macchia per confermare le proteine EV nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di veicoli elettrici in frazioni. In questo studio, le vescicole extracellulari vengono estratte e purificate da tutto il tessuto.
A seguito dell'ultracentrifugazione del gradiente di iodixanolo dal 10 al 30%, si può vedere una popolazione di veicoli elettrici leggeri migrare fino alla frazione due, mentre una popolazione di veicoli elettrici densi può essere vista migrare fino alla frazione cinque, a seconda del tipo di tessuto. Le immunoblot rappresentative delle frazioni gradienti mostrano l'efficiente separazione e purificazione dei piccoli veicoli elettrici derivati dal tumore nella frazione cinque. In particolare, i campioni di tumore al polmone appaiono arricchiti in veicoli elettrici densi rispetto ai veicoli elettrici leggeri precedentemente raccolti da tutto il tessuto cerebrale.
L'analisi rappresentativa del tracciamento delle nanoparticelle e la microscopia elettronica delle vescicole derivate dai tessuti nella frazione predominante contenente vescicole dimostrano l'arricchimento e la conservazione di intere vescicole. Coerentemente con le dimensioni e la struttura note dei piccoli veicoli elettrici. I veicoli elettrici interstiziali rappresentano obiettivi promettenti per lo sviluppo di nuovi test diagnostici o prognostici sul biomarcatore.
Questa tecnica fornisce ai ricercatori strumenti per l'estrazione e la purificazione delle vescicole per l'utilità a valle. A seguito dell'estrazione di veicoli elettrici a tessuto intero o lysed, può essere eseguita un'ampia caratterizzazione di vescicole, comprese analisi proteomiche, genomiche e lipidomiche. Inoltre, i campioni possono essere utilizzati per approcci più mirati.
Le vescicole isolate direttamente dai campioni di tessuto possono fornire ulteriori informazioni sui meccanismi della malattia, compresa la genesi del tumore, e possono fornire importanti strumenti diagnostici o prognostici in futuro.
