Il lavoro svolto per sviluppare questo protocollo è stato sostenuto dal National Institutes of Health [AR072609].

Principi e protocolli dei test meccanici per la suscettibilità alle fratture ossee

<ol>
	<li>Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+with+rehydration,+preservation+in+ethanol+influences+the+mechanical+properties+of+bone+and+how+bone+responds+to+experimental+manipulation.">Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation.</a> Bone. 97, 49-53 (2017).</li><li>Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+biomechanical+mechanisms+in+mouse+models:+practical+guidelines+for+systematically+evaluating+phenotypic+changes+in+the+diaphyses+of+long+bones.">Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).</li><li>Eds Burr, D. B., Allen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic and Applied Bone Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).</li><li>Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+scanning+and+analysis+of+mouse+bones.">MicroCT for scanning and analysis of mouse bones.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruker+microCT+NRecon:+An+overview.">Bruker microCT NRecon: An overview.</a> , (2023).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Durante il processo di scansione e test, ci sono momenti in cui la risoluzione dei problemi e l'ottimizzazione sono appropriate. Il primo di questi si verifica quando si esegue la scansione delle ossa utilizzando μCT. Mentre molti sistemi sono dotati di un supporto in cui un oggetto può essere tenuto e scansionato, i supporti personalizzati possono essere fabbricati per scansionare più ossa contemporaneamente. La scansione di più ossa può essere un ottimo punto per l'ottimizzazione, ma è necessario prestare attenzi...

Il test meccanico dell'osso è il metodo principale per estrarre informazioni funzionali relative alla suscettibilità di un osso alla frattura. Negli studi preclinici, possono essere utilizzate diverse modalità di test, ma di gran lunga la più comune è la flessione delle ossa lunghe. Questi test sono facili da eseguire e possono essere utilizzati su ossa di dimensioni variabili dall'uomo al topo. Poiché i topi sono uno degli animali più comunemente studiati nella ricerca preclinica, questo protocollo si concentrerà sui test di flessione eseguiti sui femori e sulle tibie dei topi.
Prima di eseguire le prove di flessione, le ossa devono essere adeguatamente raccolte e conservate. I metodi di conservazione più comuni sono stati tradizionalmente il congelamento delle ossa in una garza imbevuta di soluzione salina, il congelamento in soluzione fisiologica da sola o la disidratazione delle ossa in etanolo 1. È stato dimostrato che le ossa conservate in etanolo hanno una maggiore rigidità e modulo elastico e una diminuzione dei parametri di deformazione rispetto a quelle conservate congelate1. Anche reidratare le ossa prima del test non ripristina queste proprietà ai livelli normali 1. La conservazione immersa nella soluzione fisiologica potrebbe causare danni all'osso poiché la pressione viene esercitata mentre la soluzione salina si espande. Inoltre, sarebbe necessario uno scongelamento completo della soluzione per rimuovere le ossa per la scansione della tomografia microcomputerizzata (μCT). Di conseguenza, il congelamento delle ossa appena raccolte in garze imbevute di soluzione salina è diventato il metodo di conservazione standard ed è raccomandato in tutto questo protocollo.
Poiché le dimensioni e la forma di un osso influenzano la sua forza di massa e molti modelli di malattia alterano significativamente le dimensioni e la morfologia dell'osso, i principi ingegneristici vengono utilizzati per normalizzare gli effetti delle dimensioni per produrre proprietà che stimano il comportamento del tessuto2. Questo approccio richiede la geometria della sezione trasversale della posizione del guasto, che viene più comunemente acquisita utilizzando μCT per creare scansioni delle ossa prima del test. μCT è ampiamente utilizzato grazie alla sua disponibilità e all'elevata risoluzione dell'immagine. Inoltre, i contributi dei tessuti molli non sono inclusi e la scansione non richiede fissazione chimica o altre modifiche all'osso 3,4. In tutte le forme di TC, una sorgente di raggi X viene focalizzata su un oggetto mentre un rivelatore sull'altro lato dell'oggetto misura l'energia di raggi X risultante. Questo produce un'ombra a raggi X del campione che può essere convertita in un'immagine 3,5. L'oggetto da scansionare viene ruotato (o la sorgente di raggi X e il rivelatore vengono ruotati attorno al campione), generando immagini che possono essere ricostruite in un set di dati tridimensionali che rappresenta l'oggetto5.
La risoluzione di scansione, ovvero la distanza tra due oggetti che possono essere risolti singolarmente, viene controllata modificando la dimensione nominale del voxel o la dimensione di un pixel nell'immagine risultante. È generalmente accettato che gli oggetti debbano essere almeno due volte le dimensioni di un singolo voxel per essere identificati3, ma un rapporto più alto consentirà una maggiore precisione. Inoltre, i voxel più grandi sono più inclini agli effetti di volume parziale: quando un singolo voxel contiene tessuti di densità variabile, gli viene assegnata la media di queste densità, piuttosto che la densità specifica di un singolo tessuto, il che può portare a una sovra- o sotto-stima delle aree tissutali e della densità minerale3. Sebbene questi problemi possano essere attenuati scegliendo voxel di dimensioni inferiori, l'utilizzo di una risoluzione più elevata non garantisce l'eliminazione degli effetti di volume parziale e potrebbe richiedere tempi di scansione più lunghi3. Quando si esegue la scansione delle ossa ex vivo, si raccomanda generalmente una dimensione del voxel di 6-10 μm per valutare con precisione l'architettura trabecolare delle ossa di topo. Per l'osso corticale può essere utilizzata una dimensione del voxel più grande di 10-17 μm, anche se dovrebbe essere utilizzata la dimensione del voxel più piccola e ragionevole. Questo protocollo utilizza una dimensione del voxel di 10 μm, che è abbastanza piccola da differenziare le proprietà trabecolari chiave e ridurre al minimo gli effetti del volume parziale senza lunghi tempi di scansione.
Anche le impostazioni dell'energia dei raggi X e del filtro energetico devono essere selezionate con attenzione, poiché l'elevata densità minerale e lo spessore del tessuto osseo attenuano e alterano notevolmente lo spettro di energia dei raggi X trasmessi. Si presume generalmente che, poiché lo spettro dei raggi X emessi è equivalente allo spettro che esce dall'oggetto6, l'uso di raggi X a bassa energia su oggetti densi come l'osso può portare a un artefatto noto come indurimento del fascio7. Si consiglia una tensione più elevata di 50-70 kVp durante la scansione di campioni ossei per ridurre l'incidenza di questi artefatti5. Inoltre, l'inserimento di un filtro energetico in alluminio o rame crea un fascio di energia più concentrato, riducendo ulteriormente gli artefatti 4,7. In questo protocollo verrà utilizzato un filtro in alluminio da 0,5 mm.
Infine, il passo di rotazione della scansione e la lunghezza di rotazione (ad esempio, 180°-360°), insieme controllano il numero di immagini acquisite, che determina la quantità di rumore nella scansione finale4. La media di più fotogrammi in ogni passaggio può ridurre il rumore ma può aumentare il tempo di scansione4. Questo protocollo utilizza un passo di rotazione di 0,7 gradi e una media dei frame di 2.
Un'ultima nota sulla scansione: i fantocci di calibrazione dell'idrossiapatite devono essere scansionati utilizzando le stesse impostazioni di scansione delle ossa sperimentali per consentire la conversione dei coefficienti di attenuazione in densità minerale in g/cm35. Questo protocollo utilizza fantocci di 0,25 g/cm3 e 0,75 g/cm3 di idrossiapatite, sebbene siano disponibili fantocci diversi. Si noti che alcuni sistemi di scansione utilizzano fantocci interni come parte della calibrazione giornaliera del sistema.
Una volta completata la scansione, le proiezioni angolari vengono ricostruite in immagini in sezione trasversale dell'oggetto, in genere utilizzando il software in dotazione del produttore. Qualunque sia il sistema utilizzato, è importante assicurarsi che l'intero osso venga catturato nella ricostruzione e che la soglia sia impostata in modo appropriato per consentire il riconoscimento dell'osso rispetto al non osso. Dopo la ricostruzione, è fondamentale ruotare tutte le scansioni in tre dimensioni in modo che le ossa siano orientate in modo coerente e correttamente allineate con l'asse trasversale, sempre utilizzando il software del produttore.
Dopo la rotazione, le regioni di interesse (ROI) per l'analisi possono essere selezionate in base al fatto che si desiderino proprietà corticali, proprietà trabecolari o geometria della frattura per la normalizzazione meccanica. Per quest'ultimo, le ROI devono essere selezionate dopo il test misurando la distanza dal sito di frattura a un'estremità dell'osso e utilizzando la dimensione del voxel per determinare la posizione della fetta corrispondente nel file di scansione. La regione selezionata deve essere lunga almeno 100 μm, con il punto di frattura al centro approssimativo del ROI, per fornire una stima adeguata4.
Con i ROI selezionati, sono necessarie due proprietà per la normalizzazione meccanica (per calcolare la sollecitazione e la deformazione di flessione): la distanza massima dall'asse di flessione neutro alla superficie in cui viene avviato il cedimento (si presume che sia la superficie caricata in tensione, determinata dalla configurazione di prova) e il momento di inerzia dell'area attorno all'asse neutro (anch'esso dipendente dalla configurazione di prova). Questo protocollo consiglia l'uso di un codice personalizzato per determinare questi valori. Per accedere al codice, contattare direttamente l'autore corrispondente o visitare il sito Web del laboratorio all'indirizzo https://bbml.et.iupui.edu/ per ulteriori informazioni.
Una volta completata la scansione μCT, è possibile iniziare i test meccanici. Le prove di flessione possono essere eseguite in configurazioni a quattro o tre punti. Le prove di flessione a quattro punti sono preferite in quanto eliminano lo sforzo di taglio nell'osso tra i punti di carico, consentendo la flessione pura in questa regione3. L'osso si fratturerà quindi a causa della tensione, creando un cedimento che è più rappresentativo delle vere proprietà di flessione dell'osso3. Tuttavia, l'osso deve essere caricato in modo tale da fornire lo stesso carico in entrambi i punti di carico (questo può essere facilitato con una testa di carico girevole). Nei test di flessione a tre punti, c'è un grande cambiamento nella sollecitazione di taglio dove il punto di carico incontra l'osso, che provoca la rottura dell'osso in questo punto a causa del taglio, non della tensione3. Gli standard ASTM raccomandano che i materiali sottoposti a flessione dovrebbero avere un rapporto lunghezza-larghezza di 16:1, il che significa che la lunghezza della campata di supporto dovrebbe essere 16 volte maggiore della larghezza dell'osso per ridurre al minimo gli impatti del taglio 8,9. Questo è spesso impossibile da ottenere quando si testano piccole ossa di roditori, quindi la campata di carico viene semplicemente resa il più grande possibile ma con il più piccolo cambiamento possibile nella forma della sezione trasversale. Inoltre, quando si esegue la flessione a quattro punti, il rapporto tra le lunghezze della campata inferiore e superiore dovrebbe essere ~3:18, che di solito può essere raggiunto nella tibia, ma è difficile nel femore più corto. Inoltre, le pareti corticali più sottili dei femori li rendono suscettibili alla deformazione ad anello che cambia la forma della sezione trasversale dell'osso durante il test (questo può essere accentuato nei test a quattro punti poiché è necessaria una forza maggiore per indurre lo stesso momento flettente rispetto alla flessione a tre punti). Pertanto, la flessione a tre punti verrà utilizzata per i femori di topo mentre la flessione a quattro punti verrà utilizzata per le tibie in tutto questo protocollo.
Infine, è importante alimentare adeguatamente lo studio per l'analisi statistica. Una raccomandazione generale per i test meccanici è quella di avere una dimensione del campione di 10-12 ossa per gruppo sperimentale per essere in grado di rilevare le differenze, poiché alcune proprietà meccaniche, in particolare i parametri post-rendimento, possono essere molto variabili. In alcuni casi, ciò può significare iniziare con un campione di animali di dimensioni più elevate, dato l'attrito che potrebbe verificarsi durante lo studio. L'analisi della dimensione del campione utilizzando i dati esistenti deve essere completata prima di tentare uno studio.
Ci sono numerose limitazioni e ipotesi, ma i test di flessione possono fornire risultati abbastanza accurati, soprattutto quando le differenze relative tra i gruppi sono di interesse. Queste proprietà, insieme all'analisi dell'architettura trabecolare e della morfologia corticale, possono fornire una migliore comprensione degli stati patologici e dei regimi di trattamento. Se si presta attenzione a quegli aspetti dell'esperimento che sono sotto il nostro controllo (ad esempio, la raccolta, la conservazione, la scansione e il test), possiamo essere sicuri che siano stati generati risultati accurati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAn</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataViewer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Rotation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Coding platform used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software&#160;&#160;</td>
			<td>Micro Photonics Inc</td>
			<td>SKY-016814</td>
			<td>Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical considerations for the design, execution, and interpretation of studies involving whole-bone bending tests of rodent bones

La fragilità scheletrica che porta alla frattura è una crisi di salute pubblica americana che provoca 1,5 milioni di fratture ogni anno e 18 miliardi di dollari di costi diretti per l'assistenza. La capacità di comprendere i meccanismi alla base della malattia ossea e la risposta al trattamento non è solo auspicabile, ma fondamentale. I test meccanici dell'osso sono una tecnica preziosa per comprendere e quantificare la suscettibilità di un osso alla frattura. Sebbene questo metodo sembri semplice da eseguire, è possibile che si raggiunga conclusioni inappropriate e imprecise se le ipotesi e i passaggi chiave vengono ignorati dall'utente. Ciò è stato osservato in tutte le discipline, poiché gli studi continuano a essere pubblicati con un uso improprio dei metodi e un'interpretazione errata dei risultati. Questo protocollo servirà come base per i principi associati ai test meccanici insieme all'applicazione di queste tecniche, dalle considerazioni sulle dimensioni del campione attraverso la raccolta e la conservazione dei tessuti, all'analisi e all'interpretazione dei dati. Con questo in mano, è possibile ottenere preziose informazioni sulla suscettibilità di un osso alla frattura, favorendo la comprensione sia per la ricerca accademica che per le soluzioni cliniche.

Mechanical testing of bone is the primary method to extract functional information related to a bone&#39;s susceptibility to fracture. In preclinical studies, several testing modalities can be used but by far the most common is the bending of long bones. These tests are easy to perform and can be used on bones ranging in size from human to mouse. As mice are one of the most commonly studied animals in preclinical research, this protocol will focus on bending tests performed on the femora and tibiae of mice.
Prior to performing bending tests, bones must be properly harvested and stored. The most common storage methods have traditionally been freezing bones in saline-soaked gauze, freezing in saline alone, or dehydrating bones in ethanol 1. Bones stored in ethanol have been shown to have increased stiffness and elastic modulus and decreased deformation parameters versus those stored frozen1. Even rehydrating the bones prior to testing does not recover these properties back to normal levels 1. Storing submerged in saline could cause damage to the bone since pressure is exerted as the saline expands. In addition, a complete thaw of the solution would be required to remove the bones for microcomputed tomography (&#181;CT) scanning. Consequently, freezing freshly harvested bones in saline-soaked gauze has become the standard storage method and is recommended throughout this protocol.
Because the size and shape of a bone affect its bulk strength and many disease models significantly alter bone size and morphology, engineering principles are used to normalize away the effects of size to produce properties that estimate the behavior of the tissue2. This approach requires cross-sectional geometry of the failure location, which is most commonly acquired using &#181;CT to create scans of the bones prior to testing. &#181;CT is widely used due to its availability and high image resolution. Moreover, contributions of soft tissue are not included, and scanning does not require chemical fixation or other modifications to the bone3,4. In all forms of CT, an X-ray source is focused on an object while a detector on the other side of the object measures the resulting X-ray energy. This produces an X-ray shadow of the sample that can be converted into an image3,5. The object being scanned is rotated (or the X-ray source and detector are rotated around the sample), generating images that can be reconstructed into a three-dimensional data set representing the object5.
Scan resolution, or how close together two objects can be and still be resolved individually, is controlled by changing the nominal voxel size or the size of a pixel in the resulting image. It is generally accepted that objects must be at least two times the size of a single voxel to be identified3, but a higher ratio will allow for improved precision. Further, larger voxels are more prone to partial volume effects: when a single voxel contains tissues of varying densities, it is assigned the average of these densities, rather than the specific density of a single tissue, which may lead to an over- or under-estimation of tissue areas and mineral density3. While these issues can be mitigated by choosing smaller voxel sizes, using a higher resolution does not ensure the elimination of partial volume effects and may require longer scan times3. When scanning bones ex vivo, a voxel size of 6-10 &#181;m is generally recommended to accurately assess the trabecular architecture of mouse bones. A larger voxel size of 10-17 &#181;m can be used for cortical bone, although the smallest reasonable voxel size should be used. This protocol uses a 10 &#181;m voxel size, which is small enough to differentiate key trabecular properties and minimize partial volume effects without extensive scan time.
X-ray energy and energy filter settings must also be selected carefully, as the high mineral density and thickness of bone tissue greatly attenuates and alters the transmitted X-ray energy spectrum. It is generally assumed that because the emitted X-ray spectrum is equivalent to the spectrum that exits the object6, using low-energy X-rays on dense objects such as bone can lead to an artifact known as beam hardening7. A higher voltage of 50-70 kVp is recommended when scanning bone samples to reduce the incidence of these artifacts5. In addition, inserting an aluminum or copper energy filter creates a more concentrated energy beam, further minimizing artifacts4,7. A 0.5 mm aluminum filter will be used throughout this protocol.
Finally, the scan rotation step and rotation length (e.g., 180&#176;-360&#176;), together control the number of images captured, which determines the amount of noise in the final scan4. Averaging multiple frames in each step can reduce noise but may increase scan time4. This protocol uses a rotation step of 0.7 degrees and a frame averaging of 2.
One final note about scanning: hydroxyapatite calibration phantoms should be scanned using the same scan settings as the experimental bones to enable the conversion of attenuation coefficients to mineral density in g/cm35. This protocol uses phantoms of 0.25 g/cm3 and 0.75 g/cm3 of hydroxyapatite, although different phantoms are available. Note that some scanning systems use internal phantoms as part of daily system calibration.
Once scanning is complete, the angular projections are reconstructed into cross-sectional images of the object, typically using the manufacturer&#39;s accompanying software. Whatever system is used, it is important to ensure that the whole bone is captured in the reconstruction and that thresholding is set appropriately to allow for the recognition of bone versus non-bone. After reconstruction, it is critical to rotate all scans in three dimensions so that bones are oriented consistently and properly aligned with the transverse axis, again using the manufacturer&#39;s software.
Following rotation, regions of interest (ROI) for analysis may be selected based on whether cortical properties, trabecular properties, or fracture geometry for mechanical normalization are desired. For the latter, ROIs should be selected after testing by measuring the distance from the fracture site to one end of the bone and using voxel size to determine the corresponding slice location in the scan file. The selected region should be at least 100 &#181;m in length, with the fracture point at the approximate center of the ROI, to provide adequate estimation4.
With ROIs selected, two properties are needed for mechanical normalization (to calculate bending stress and strain): the maximum distance from the neutral bending axis to the surface where failure is initiated (assumed to be the surface loaded in tension, determined by the testing setup), and the area moment of inertia around the neutral axis, (also dependent on testing setup). This protocol recommends the use of a custom code to determine these values. For access to the code, contact the corresponding author directly or visit the lab website at&#160;https://bbml.et.iupui.edu/ for more information.
Once &#181;CT scanning has been completed, mechanical testing can begin. Bending tests can be performed in either four-point or three-point configurations. Four-point bending tests are preferred as they eliminate shear stress in the bone between loading points, allowing for pure bending to occur in this region3. The bone will then fracture due to tension, creating a failure that is more representative of the true bending properties of the bone3. However, the bone must be loaded in such a way as to deliver the same load at both loading points (this can be facilitated with a pivoting loading head). In three-point bending tests, there is a large change in shear stress where the load point meets the bone, which causes the bone to break at this point due to shear, not tension3. ASTM standards recommend materials undergoing bending should have a length-to-width ratio of 16:1, meaning the length of the support span should be 16 times larger than the width of the bone to minimize impacts of shear8,9. This is often impossible to achieve when testing small rodent bones, so the loading span is simply made as large as possible but with as small of a change in cross-sectional shape as possible. Moreover, when performing four-point bending, the ratio between the lengths of the lower and upper span should be ~3:18, which can usually be achieved in the tibia, but it is difficult in the shorter femur. In addition, the thinner cortical walls of femurs make them susceptible to ring-type deformation which changes the shape of the bone cross-section during the test (this can be accentuated in four-point tests as a greater force is required to induce the same bending moment compared to three-point bending). Therefore, three-point bending will be utilized for mouse femora while four-point bending will be used for tibiae throughout this protocol.
Finally, it is important to properly power the study for statistical analysis. A general recommendation for mechanical testing is to have a sample size of 10-12 bones per experimental group to be able to detect differences, as some mechanical properties, especially postyield parameters, can be highly variable. In some cases, this may mean starting with a higher animal sample size given attrition that could occur during the study. Sample size analysis using existing data should be completed prior to attempting a study.
There are numerous limitations and assumptions, but bending tests can provide quite accurate results, especially when relative differences between groups are of interest. These properties, together with the analysis of trabecular architecture and cortical morphology, can provide better insight into disease states and treatment regimens. If care is taken with those aspects of the experiment that are in our control (e.g., harvesting, storing, scanning, and testing), we can feel confident that accurate results have been generated.

Autore in primo piano: Migliorare l'accuratezza e la riproducibilità nei test di flessione dell'intero osso 

Considerazioni pratiche per la progettazione, l'esecuzione e l'interpretazione di studi che coinvolgono prove di flessione dell'osso intero di ossa di roditori

The current experimental challenges of bending tests include:Consistent placing of the bones in the same orientation, documenting the break progress of the bone during the test, and interpretation of complex results. Our protocol provides a guide not only for the testing procedure and data analysis for whole-bone bending tests, but also for sample preparation and storage. And this is the first instance where the entire protocol has been presented.Whole-bone mechanical testing is a quick and simple method to obtain measures of bone fracture susceptibility when compared to other testing methods.

Al termine della scansione TC, la maggior parte delle scansioni inadeguate può essere rilevata nella ricostruzione. Spesso, le scansioni scadenti avranno un'elevata compensazione del disallineamento che è un chiaro indicatore di un errore durante la scansione. Tuttavia, possono verificarsi errori in altri passaggi e potrebbero anche portare a dati imprecisi. Questi errori possono spesso essere individuati durante l'esame delle singole proprietà architettoniche calcolate. Se i valori sono molto al di fuori dell'interva...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Accuracy and Reproducibility in Whole Bone Bending Tests at JoVE.com

L'analisi meccanica delle ossa dei roditori è un metodo prezioso per estrarre informazioni sulla suscettibilità di un osso alla frattura. In mancanza di un'adeguata comprensione pratica, i risultati possono essere sovrainterpretati o non validi. Questo protocollo servirà come guida per garantire che i test meccanici vengano eseguiti in modo accurato per fornire dati validi e funzionali.

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

Le attuali sfide sperimentali dei test di flessione includono:Posizionamento coerente delle ossa nello stesso orientamento, documentazione del progresso della rottura dell'osso durante il test e interpretazione di risultati complessi. Il nostro protocollo fornisce una guida non solo per la procedura di analisi e l'analisi dei dati per i test di flessione dell'osso intero, ma anche per la preparazione e la conservazione del campione. E questo è il primo caso in cui è stato presentato l'intero protocollo.Il test meccanico dell'intero osso è un metodo rapido e semplice per ottenere misure della suscettibilità alla frattura ossea rispetto ad altri metodi di test.

practical-considerations-for-design-execution-interpretation-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

581 Views.  Indiana University-Purdue University Indianapolis. Le attuali sfide sperimentali dei test di flessione includono:Posizionamento coerente delle ossa nello stesso orientamento, documentazione del progresso della rottura dell'osso durante il test e interpretazione di risultati complessi. Il nostro protocollo fornisce una guida non solo per la procedura di analisi e l'analisi dei dati per i test di flessione dell'osso intero, ma anche per la preparazione e la conservazione del campione. E questo è il primo caso in cui è stato presentato l'inter...

Video: Autore in primo piano: Migliorare l'accuratezza e la riproducibilità nei test di flessione dell'intero osso 

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

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Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#39;s Susceptibility to Fracture

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#039;s Susceptibility to Fracture  

After harvesting the femur and tibia from the euthanized mouse, obtain a six to 10 micrometer resolution micro CT scan reconstructed for each sample to calculate for exercise geometry. Thaw all the bones for testing, and ensure to test all bones from the same experiment in one session. Now locate a load cell with sensitivity and capacity suitable for the specimen.Considering the failure range of the specimen, select a load cell with 50%more capacity while maximizing sensitivity. Locate the loading and support span fixtures. Install the load cell and fixtures by screwing the load cell onto the upper support of the tester, attaching the upper loading fixture to the load cell and mounting the lower fixture to the bottom support of the tester.Then select a support span length, which will remain constant for all samples. Use the shortest bone in the sample set to determine the support span distance, and properly orient the bone between the fixtures. To perform a three-point bending test of the femur.place the anterior surface of the bone against the support span, ensuring the position is within the diaphysis of the sample. Exclude the third trochanter on the proximal end and the transition point where the bone widens into the metaphysis and condyles on the distal end. Ensure the loading span is centered within the support span and contains a uniform region of the bone.Then measure and record the support span distance. Once the support span has been set and recorded, bring the lower fixture close to the upper fixture with enough room between the two for a bone to be placed. Place the bone back into saline or rehydrated with a saline bolus.Ensure all fixture parts are tight and free of movement. In the mechanical tester software, design a bending test profile with a slow displacement ramp rate to avoid viscoelastic effects to load the bone until it fails. After creating a testing profile, create distinct folders for every study group.Select a properly thawed bone, then measure and record its full length using calipers. Load the bone sample onto the fixture in the proper orientation. Alter the file name to reflect the particulars of the sample being tested and save each test in its corresponding folder.Zero the load and activate the system's mover, ensuring it's not in load or displacement control. Carefully apply a slight preload to the bone to secure its position. Avoid compromising the sample.Aim for a preload of about 0.25 Newtons. Make sure the desired bone orientation is kept consistent before moving forward. Hydrate the sample by generously dousing it with saline.On the software, initiate the bending test by selecting start or run. It's crucial to observe the sample for the duration of the test accurately, noting down any occurrences of issues. Monitor closely as the bone starts to fracture.Tests stop automatically when they reach their set limits. But if there's a failure, stop the test manually to avoid damaging the load cell. Once testing is complete, measure the length from the distal end to the breakpoint using calipers and record it.