Creazione di coppie di modelli in vivo/in vitro derivati dal paziente abbinate di organoidi derivati da PDX e PDX per la ricerca farmacologica sul cancro

Questo protocollo può essere utilizzato per stabilire una libreria abbinata di xenoinnesti accoppiati derivati dal paziente, o PDX, e corrispondenti linee organoidi derivate dal paziente. Il vantaggio di questo metodo è che può essere utilizzato per creare organoidi utilizzando PDX per lo screening in vitro, con conseguente coppie abbinate di modelli in vivo / in vitro. Inizia raccogliendo i tumori ed elaborando il tessuto come descritto nel manoscritto testuale.

Dopo la digestione dei tessuti, pipettare il tessuto su e giù con una pipetta di plastica sterile da cinque millilitri. Quindi aggiungere 20 millilitri di AD+ all'omogeneato e filtrarlo con un filtro cellulare da 100 micrometri. Lavare il filtrato due volte con AD+, quindi trasferirlo su un tubo di plastica e centrifugarlo a 450 volte G per cinque minuti.

Rimorsi le cellule in BME e tenerle sul ghiaccio. Per preparare la coltura organoide, trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra a sei porri e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere due millilitri di mezzi organoidi a ciascun pozzo e mentre l'immagine del rappresentante scende al microscopio.

Mantenere le colture organoidi a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con variazioni medie ogni tre o quattro giorni e passare a un rapporto uno a due ogni sette giorni. Dopo aver dissociato gli organoidi, farli passare attraverso un filtro da 70 micrometri in un tubo di plastica da 50 millilitri. Contare gli organoidi al microscopio e riprernerli in BME sul ghiaccio per una concentrazione finale del 5%Aggiungere 50 microlitri della sospensione organoide in ogni piastra da 384 poggia-porsi con un distributore di liquidi per una densità di semina di 200 PDXO CR2110 per pozzo.

Utilizzare il distributore digitale per aggiungere SN38 a ogni pozzo in diluizione seriale. Creare una mappa della piastra utilizzando lo strumento software del distributore digitale. I trattamenti dovrebbero includere un veicolo di controllo negativo con redditività del 100% e controllo positivo di cinque staurosporine micromolare con vitalità dello 0%.

Al termine, riposizionare le piastre a 384 pozzi trattate con farmaci in un'incubatrice di 37 gradi Celsius. Sotto microscopia ottica, PDXO CR2110 mostra una tipica morfologia cistica che dimostra la somiglianza tra organoidi derivati dalla PDX e organoidi derivati dal paziente nelle stesse condizioni di coltura. L'esame istopatologico da parte della colorazione H&E rivela che le strutture tissutali e i tipi cellulari di PDXO CR2110 sono simili all'originale PDX CR2110.

I confronti del profilo genomico di PDX e PDXO dimostrano una correlazione del 94,92% dell'espressione del trascritoma e una concordanza del 97,67% delle mutazioni del DNA, suggerendo una somiglianza genomica complessiva tra questa coppia di modelli. I test di sensibilità del farmaco sono stati eseguiti su PDXO CR2110 in piastre da 384 pozzi. PDXO CR2110 era sensibile all'irinotecan e resistente al cisplatino, coerente con i risultati del trattamento PDX.

La coppia abbinata di modelli in vitro e in vivo può complimentarsi a vicenda per lo screening e la convalida in vitro in vivo, migliorando il tasso di successo della scoperta di farmaci e riducendo potenzialmente i tassi di attrito nello sviluppo clinico.