Tecnica per l'isolamento e la coltura di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo della mascella di ratto

Questo studio fornisce un metodo efficace e stabile per ottenere in breve tempo una quantità sufficiente di midollo osseo mascellare di alta qualità, cellule staminali mesenchimali con una forte capacità di differenziazione. Il metodo basato sulla nicchia può essere applicato nell'isolamento di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di ratto. Il nostro studio isola con successo cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mascellare di elevata purezza, offrendo una fonte cellulare sostanziale per l'ingegneria del tessuto osseo mascellare, in particolare nel contesto della riparazione dei difetti ossei.

Questi progressi sono molto promettenti per il settore. Per iniziare, estrai una mandibola di ratto da un ratto soppresso. Posizionare il becco di rongeurs all'incrocio degli incisivi della mandibola di un ratto estratto e del primo molare.

Tagliare il collegamento tra gli incisivi inferiori e la mandibola, quindi estrarre completamente gli incisivi inferiori. Rimuovere tutti i molari, seguiti dal ramo mandibolare. Ora separare la parte centrale della mandibola lungo il bordo distale dell'ultimo molare ed esporre la cavità midollare.

Quindi, riempire una siringa monouso da un millilitro con il terreno completo alfa MEM. Inserire l'ago nella cavità del midollo osseo. Sciacquare ripetutamente il midollo osseo in una piastra di coltura contenente terreno completo alfa MEM fino a quando l'osso diventa bianco.

Trasferire la soluzione lavata in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare la soluzione a 800 G per tre minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, pipettare il surnatante, quindi aggiungere 10 millilitri di terreno completo alfa MEM alla provetta.

Risospendere il pellet nel terreno e trasferire la sospensione in un nuovo piatto di coltura largo 10 centimetri. Ora usa un rongeur d'osso per dividere la mandibola arrossata in fette d'osso. Trasferire le fette di osso in una provetta contenente tre millilitri di soluzione di collagenasi di tipo II allo 0,1%.

Mettere il composto di fette di ossa in uno shaker per 90 minuti a 37 gradi Celsius e 200 giri/min. Al termine dell'incubazione, centrifugare la mandibola digerita a 800 G per tre minuti a temperatura ambiente. Pipettare il surnatante per scartarlo, quindi trasferire le cellule raccolte e le fette di osso digerito in piastre a pozzetti contenenti 10 millilitri di terreno completo alfa MEM.

Incubare le colture a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con un'integrazione di anidride carbonica del 5%. Dopo 72 ore, sostituire metà del terreno di coltura con terreno fresco. Quando le cellule aderenti sono confluenti all'80-90%, farle passare in un rapporto di uno a due.

Rimuovere le fette di osso durante la seconda sottocoltura. Dopo 72 ore di coltura, la maggior parte delle cellule erano sospese e rotonde, con alcune aderenti alla parete. Le colonie aderenti che erano fusi o simili a fibroblasti sono apparse dopo cinque giorni di coltura.

Le cellule aderenti hanno raggiunto il 90% di confluenza entro il settimo giorno e hanno formato una forma di banco di pesci. Le celle passate mostravano omogeneità, erano prevalentemente a forma di fuso e in uno schema a vortice dopo la confluenza.