Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award, l&#39;American Cancer Society Research istituzionale Grant (IRG # 58-006-53), al Centro Purdue University for Cancer La ricerca e la Canadian Institutes of Health Research e Alberta Cancer Consiglio Initiative di ricerca del programma. MP è stato sostenuto dal National Institutes of Health, National Cancer Institute, la prevenzione del cancro Programma di Tirocinio (R25CA128770; PI: D. Teegarden) amministrato dal Oncologico Sciences Center e il Discovery Learning Research Center presso la Purdue University.

1. Preparazione preliminare <ol><li> Tenere pipette sierologiche sterili e relativi puntali a 4 ° C. Risoluzione dei problemi: gel Matrigel a temperatura ambiente (RT); utilizzando pipette fredde e suggerimenti impediranno Matrigel di gelificazione durante l&#39;installazione cultura. </li><li> Scongelare una bottiglia di Matrigel a 4 ° C per una notte. </li></ol> 2. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparazione della fibronectina soluzione stock: Fare un / ml soluzione madre 1 mg di fibronectina sciogliendo 100 mg fibronectina umana in 100 ml di acqua distillata. Una volta che la fibronectina è dissolta, filtro sterile, un&#39;aliquota, e conservare a 4 ° C per un massimo di 6 mesi. Risoluzione dei problemi: se fibronectina non si scioglie rapidamente incubare la soluzione per pochi minuti in un set da bagno di acqua a 37 ° C. </li><li> Preparazione di 10x PBS: sciogliere 80 g di cloruro di sodio NaCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2 g KCl e 2,4 g di KH 2 PO <sub&gt; 4 in 1 L di acqua distillata. Regolare il pH a 7,4, filtro sterile e conservare a 4 ° C per un massimo di 6 mesi. </li><li> Preparazione del tampone di neutralizzazione 20: Fai una soluzione contenente HEPES 100 mM in 2x tampone fosfato salino (PBS) con 1 M HEPES e 10x soluzioni stock PBS. Aggiustare il pH della soluzione a 7,0. Conservare a 4 ° C per 2-3 mesi. </li><li> Preparazione della soluzione di 2 mg / ml di coda di ratto collagene di tipo I: fare una soluzione 2 mg / ml di collagene I nel tampone di neutralizzazione (passo 2.3). Agitare la soluzione a bassa velocità e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Poiché questo collagene è molto viscoso, evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante il pipettaggio. Si raccomanda di preparare la soluzione di collagene I fresca ogni volta. Mantenere la soluzione in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparazione del rivestimento endosteale (Rend): Mescolare 1 mg / magazzino fibronectina ml con 2 mg / ml di collagene I stock (punti 2.1 e 2.4) per una concentrazione finale di 77 mg / ml e 29 mcg / ml, rispettivamente, in 1x &amp;# 160; PBS sterile. Mescolare e conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese. </li><li> Preparazione della matrice ossea ricostruita (RBM): <ol><li> Preraffreddare 1,5 ml microprovette su ghiaccio. Conservare tutte le soluzioni della matrice sul ghiaccio in ogni momento. </li><li> Miscelare 4 parti Matrigel (concentrazione Matrigel varia da lotto a lotto, ma le variazioni sono risultate essere trascurabile), 2,5 parti di 1 mg / ml di fibronectina e 1 parte di 2 mg / ml di collagene I sul ghiaccio prima pipettaggio Matrigel in il tubo con i puntali delle pipette fredde e quindi aggiungere fibronectina e collagene I. Matrigel inizierà solidificare a temperature superiori a 4 ° C, in modo da lavorare in fretta, mentre il pipettaggio Matrigel. Mescolare la matrice molto delicatamente pipettando su e giù, evitare di introdurre bolle. Tenere le provette in ghiaccio durante la miscelazione del RBM. </li></ol></li><li> Preparazione del mezzo di crescita del midollo osseo (BMGM): Rendere 500 ml di BMGM contenenti 6,2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 -6 M sodio succinato, 10 -6 M idrocortisone, il 20% del plasma umano (normale o maligno raccolti da donatori sani o pazienti), e l&#39;1% di penicillina / streptomicina in RPMI-1640. CaCl 2, sodio succinato, e gli integratori idrocortisone possono essere conservati a -80 ° C per&gt; 6 mesi come 1.000 soluzioni di riserva x. Quando cresce linee cellulari, siero bovino fetale (FBS) può essere sostituito da plasma umano. </li><li> Preparazione del 10% formalina tamponata neutra (NBF): Aggiungi il 37% di soluzione di formaldeide magazzino a 1x PBS al 10% v / v Mescolare bene e conservare a temperatura ambiente per 2-3 settimane al riparo dalla luce. </li><li> Preparazione del 1% di albumina sierica bovina (BSA): Pesare giusta quantità di BSA e scioglierlo in 1x PBS. Conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 1 settimana. Soluzione BSA tende ad ottenere contaminati se conservato in frigorifero per periodi più lunghi. In alternativa, la soluzione BSA può essere aliquotato e congelato a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. Evitare cicli di congelamento-scongelamento. </li><li> Preparazione della soluzione di recupero di cellule (CRS): Make 5 EDTA mm, 1 mm vanadate sodio (Na &lt;soluzione sub&gt; 3 VO 4) e 1,5 mM fluoruro di sodio (NaF) in PBS 1x. Filtro sterile e conservare a 4 ° C fino a 6 mesi. </li></ol> 3. Integrato 3-D coltura di cellule BM umano non maligne e maligne <ol><li> Purificare cellule mononucleate midollari primarie per Ficoll Plaque centrifugazione in gradiente secondo le istruzioni del produttore. Passaggio facoltativo: le cellule possono essere etichettati con 0,25 micron carbossifluoresceina diacetato, estere succinimidyl (CFSE) secondo le istruzioni del produttore per seguire la proliferazione cellulare per tutto il periodo di coltura. Risoluzione dei problemi: Se le cellule muoiono dopo CFSE colorazione, titolare la quantità di CFSE come la concentrazione dipende dal tipo di cellula; 0,25 micron funziona bene per le cellule mononucleari BM primarie. </li><li> Aggiungere 65 ml di soluzione di rend in ciascun pozzetto di un tessuto coltura trattata piastra a 48 pozzetti. Distribuire uniformemente la soluzione a coprire l&#39;intera superficie del pozzetto ed incubare per&gt; 30min a RT. </li><li> Preparare la sospensione di cellule ad una densità di 0,5 x 10 6 cellule in 10 ml di PBS 1x per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga mescolare la sospensione cellulare con 100 ml di matrice MLF per pozzetto. Mescolare le cellule e la matrice RBM pipettando gentilmente su e giù; evitare l&#39;introduzione di bolle. Mantenere la miscela cellula / matrice in ghiaccio per evitare gelificazione della matrice. Nota: il sistema RBM è completamente scalabile, per configurare il sistema in un formato non-48-bene, adegua gli importi di tutti i reagenti (matrici e medie) in base alla superficie della piastra utilizzata. Ridimensionare il numero di cellule per essere placcato conseguenza. </li><li> Aspirare il restante Rend e aggiungere la miscela di cellule / matrice nel centro di un pozzo. Rapidamente, diffondere la miscela di cellule / matrice a coprire l&#39;intera superficie del pozzetto in modo uniforme. Posizionare la piastra per 30-60 min a 37 ° C, 5% CO 2 tessuto cultura incubatore per consentire la matrice solidificare. Non agitare o disdisturbare la piastra durante l&#39;incubazione. Risoluzione dei problemi: per evitare distribuzione irregolare di cellule in RBM, mescolare bene prima di placcatura. Mescolare dopo ogni 5 ° ben placcato per evitare cellule sedimentazione al fondo della provetta. Una volta placcato, cellule non si depositano sul fondo del pozzo a causa della tensione superficiale nella matrice. Risoluzione dei problemi: per evitare distribuzione irregolare di cellule in RBM, mescolare bene prima di placcatura. Mescolare dopo ogni 5 ° ben placcato per evitare cellule sedimentazione al fondo della provetta. Una volta placcato, cellule non si depositano sul fondo del pozzo a causa della tensione superficiale nella matrice. </li><li> Preriscaldare BMGM in un bagno d&#39;acqua impostata a 37 ° C. </li><li> Dopo 30 minuti, verificare che la matrice ha impostato correttamente, si formerà un gel morbido come strato che non si muove quando la piastra è inclinata. Sovrapporre lo strato di cellule / matrice con 1 ml di caldo BMGM. Per evitare lacerazione della pipetta matrice mezzo molto delicatamente (dispensazione goccia a goccia) usandouna pipetta sierologica. Posizionare la cultura meccanismi assemblati in un 37 ° C, 5% CO 2 tessuto cultura incubatore e cultura per il periodo desiderato. Nota: vitalità cellulare viene mantenuta per almeno 30 giorni senza cambiare mezzo, se è necessaria medio cambiamento cambiare solo il 50% delle medie ogni volta. Passaggio critico: E &#39;fondamentale che il mezzo non è freddo come temperatura fredda potrebbe disturbare la matrice già impostato. Fare attenzione a non schizzare il mezzo sulla parte superiore della matrice a potrebbe rompere lo strato di matrice morbida. Risoluzione dei problemi: Se la vitalità delle cellule del sistema RBM è basso, la densità delle cellule può avere da determinare sperimentalmente quando si lavora con le cellule diverse dalle cellule mononucleate primarie da aspirati midollari. Quando si lavora con linee cellulari, diminuire il numero di cellule 10 volte, come linee cellulari immortalizzate proliferano più velocemente di cellule primarie. </li></ol> 4. Imaging &#39;In-matrix&#39; <ol><li><strong&gt; La microscopia ottica <ol><li> Immagine cellule coltivate direttamente in RBM con campo chiaro, contrasto di interferenza differenziale (DIC), confocale o altre tecniche di imaging che permettono di imaging a lunga distanza come matrice di uno spessore di circa 1 mm. Utilizzare la funzione disponibile Z-stack su molti dei microscopi per l&#39;immagine intera cultura da cima a fondo. </li></ol></li><li> Immunofluorescenza Suggerimento: Per il protocollo immunostaining sotto evitare aspirazione soluzioni colorazione / lavaggio, invece inclinare il piatto e rimuovere soluzioni con una pipetta. <ol><li> Rimuovere il BMGM utilizzando una pipetta e lavare 2-3x con 100 microlitri / lavaggio / pozzetto di RT 1x PBS. Assicurarsi che sufficiente PBS viene utilizzato per coprire l&#39;intera superficie del pozzetto. </li><li> Fix celle della matrice aggiungendo 100 pl / pozzetto (per una piastra a 48 pozzetti) del 10% NBF per 15 minuti a RT. Rimuovere NBF e lavare le cellule due volte con 100 microlitri / lavaggio / pozzetto di RT 1x PBS. Appunto: Evitare di utilizzare a freddo NBF come può liquefare la matrice. </li><li> Rimuovere PBS, aggiungere BSA 1% per 1 ora a RT o a 4 ° C per una notte per bloccare il legame non specifico degli anticorpi. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo primario in 1% BSA alla diluizione necessaria. Diluizione varierà per ogni anticorpo, verificare con il produttore o il titolare di determinare la concentrazione ottimale di anticorpi. Aggiungere 100 pl / pozzetto di soluzione di anticorpo primario e incubare secondo le istruzioni del produttore. Passaggio fondamentale: Tutte le incubazioni che coinvolgono gli anticorpi coniugati a fluorofori o coloranti fluorescenti devono essere eseguite al buio. </li><li> Rimuovere soluzione di anticorpo primario e lavare 3x con 1x PBS per 5 min. </li><li> Per la colorazione immunofluorescenza indiretta, incubare con un anticorpo secondario coniugato con sonda fluorescente per 1 ora a RT. Diluire gli anticorpi in 1% BSA a concentrazione suggerito dal produttore. </li><li> Rimuovere il secondariosoluzione ntibody e lavare 3x con 1x PBS per 5 min. Risoluzione dei problemi: Per evitare elevato background durante l&#39;imaging, titolare anticorpi secondari coniugati modo fluorescente e utilizzare la più bassa concentrazione che fornisce il segnale adeguato. Se elevato background è ancora un problema, aumentare il numero e la durata delle fasi di lavaggio, oppure utilizzare anticorpi primari direttamente coniugati, e saltare il punto 4.2.6. </li><li> Per macchiare i nuclei aggiungono 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) soluzione colorante nucleare, alla diluizione suggerito dal costruttore, e incubare per 7-10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione colorazione nucleare e lavare 2x 1x PBS per 5 min. </li><li> Rimuovere la PBS dall&#39;ultima pulizia e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio (serie regolare), sul campione per conservare fluorescenza. Immagine utilizzando apposite impostazioni di eccitazione / emissione su un microscopio a fluorescenza o confocale. Nota: Imaging dovrebbe essere fatto entro 2 giorni di colorazioneper evitare il degrado della matrice e perdita di integrità meccanismi e perdita di segnale fluorescente. Se non è ripreso immediatamente, i campioni colorati devono essere conservati a 4 ° C, al riparo dalla luce, fino imaging. </li></ol></li></ol> 5. Isolamento di cellule dal RBM <ol><li> Rimuovere delicatamente mezzo senza disturbare lo strato di matrice. Non aspirare. </li><li> Lavare le cellule 2x con sterile 1x PBS. Non aspirare. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di CRS ghiaccio freddo a ciascun pozzetto e rimuovere l&#39;intero strato di matrice insieme con le cellule, vigorosamente pipettando su e giù. Raccogliere le cellule, matrice, e CRS in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mettere sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere un ulteriore 0,5 ml CRS allo stesso bene e raccogliere tutto il materiale residuo. Trasferimento alla stessa provetta. </li><li> Vortex la miscela di cellule, matrice, e CRS e incubare in ghiaccio per 1 ora. Cellule Vortex ogni 15 min per facilitare il rilascio dalla matrice. </li><li> Controllare la miscela dopo 1 ora, senza grumi visibilidi matrice dovrebbe essere presente. Risoluzione dei problemi: se ciuffi di matrice sono ancora visibili dopo 1 ora, le cellule di trasferimento / matrix / CRS miscela in un tubo più grande, aggiungere ulteriori 2-5 ml di CRS, e incubare per altri 30-60 min. </li><li> Centrifugare le cellule in CRS a 1.000 rpm per 5-10 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di freddo 1x PBS. </li><li> Centrifugare a 1000 rpm per 5-10 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio PBS ancora una volta. </li><li> Il secondo lavaggio PBS completa il recupero delle cellule dalla matrice e cellule isolate può essere utilizzato per applicazioni a valle come l&#39;isolamento di DNA / RNA / proteine, citometria a flusso, trapianto in vivo, ecc. </li></ol>

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Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.

Il modello RBM fornisce un sistema completo in cui la composizione cellulare della BM è mantenuta ex vivo per un massimo di 30 giorni. Cellule BM coltivate in RBM self-stratificare in base alla loro funzione mimando l&#39;architettura BM trovato in vivo. Inoltre, questo è il primo sistema che permette l&#39;espansione del mieloma multiplo clone 8. I passi più critici per assicurare la robusta crescita delle cellule BM e il successo complessivo della coltura sono: 1) per ottenere una popol...

Coltura tissutale è stato sviluppato per studiare il comportamento delle cellule in un ambiente controllato per ridurre al minimo la variabilità sistemica quando si confrontano i vari processi in organismi intatti. Questo metodo è stata fondata nei primi anni del 1900 a 1,2 e si riferisce ad una tecnica in cui espianti di tessuto sono state coltivate ex vivo in un piatto di vetro. A metà del 1900 il sistema è stato adattato per far crescere le cellule disperse piuttosto che frammenti di tessuti intatti, e &#39;la cultura del tessuto&#39; i termini e &#39;di coltura cellulare&#39; diventato sinonimo 3. In tali sistemi di colture cellulari convenzionali cellule sono cresciute sulla superficie della plastica coltura di tessuti sovrapposti con terreno di coltura addizionato con diversi fattori di crescita. Due tipi di colture sono emersi sulla base delle capacità di adesione di cellule diverse: coltura di cellule aderenti, in cui le cellule si attaccano e diffondono sulla plastica coltura tissutale e colture non aderenti, in cui le cellule vengono propagate in sospensione. Fin dai primi giorni di cellacultura, più linee cellulari immortali sono state create, come HeLa 4, la prima linea di cellule di cancro umano. Queste linee cellulari hanno la capacità di proliferare indefinitamente in coltura cellulare, e la maggior parte non richiedono alcun trattamento speciale per mantenere la vitalità. L&#39;approccio riduzionista dei metodi di coltura cellulare originale è stato progettato per semplificare il sistema, per quanto possibile includendo solo i componenti minimo necessario per mantenere la vitalità e la proliferazione cellulare. Tuttavia, gli approcci di coltura cellulare semplificati non riescono a sostenere ex vivo la maggior parte dei tipi principali di cellule umane con limitata durata. Pertanto, i nuovi sistemi di coltura sono stati progettati per approssimare il microambiente tissutale più vicino possibile, permettendo così espianti di cellule di crescere in condizioni fisiologiche. In contrasto con le / approcci convenzionali di coltura cellulare riduzioniste, 3-dimensionale (3-D) sistemi di coltura stanno diventando il metodo preferito per la cultura in modo efficiente varilinee cellulari umane e cellule primarie di studiare successivamente meccanismi coinvolti nella salute e malattia, nel contesto di un microambiente favorevole. Tali sistemi 3-D sono solitamente realizzate utilizzando matrici ricostruite e / o medie, completata con fattori di crescita, per ricapitolare microambiente tissutale per studiare tipi cellulari di interesse. La prima di queste 3 dimensioni (3-D) modelli di coltura è stato sviluppato per studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria. Per fornire le cellule con condizioni native cellule epiteliali mammarie sono stati incorporati in Matrigel, collagene IV e ricca fonte-laminina di matrice extracellulare (ECM), e ricoperto con terreno di crescita. In tali condizioni, le cellule epiteliali mammarie formano cluster somiglianti acini mammaria, e dopo stimolazione con ormoni lattogenica, questi acini secreti caseina e altre proteine ​​del latte, nel Lumena cavità delle strutture acini simili. Secrezione di caseina non è stata osservata in culture normali anche dopo aggiunta di prolattina 5, Sottolineando ulteriormente il ruolo del microambiente nel preservare le caratteristiche morfologiche e fenotipiche delle cellule. Un&#39;altra dimostrazione della perdita della normale funzione cellulare quando le cellule sono prese fuori dal contesto della loro microambiente fisiologico è la dimostrazione che senza microambiente favorevole, cheratinociti non riescono a formare epidermide stratificati 6. Un certo numero di altri modelli 3-D è stato creato per permettere a ex vivo propagazione di pile 7,8. Il ruolo cruciale del microambiente nel comportamento cellulare era elegantemente dimostrata in uno studio in cui cellule epiteliali mammarie formate &quot;inside-out&quot; acini quando coltivate in collagene I matrice, rispetto al acini polarizzata corretto e che si sono formate in Matrigel. Questa perdita di corretta morfologia è invertita quando le cellule mioepiteliali-laminina produzione sono stati aggiunti alle colture collagene I 9. Inoltre, corretta microambiente è necessario per l&#39;accuratagenotipo manifestazione. Cresciuto in un piatto, cellule tumorali mammarie MCF7 trasfettate con una cellula-cellula molecola di adesione CEACAM1 si comportano esattamente come le cellule negative CEACAM non trasfettate. Tuttavia, quando coltivate in Matrigel, a contatto con la ECM, strutture tumore-come forma di tipo selvatico MCF7 mentre MCF7 cellule trasfettate con CEACAM1 ritornano ad un fenotipo e forma normale acini con Lumena vuoto, come è stato stabilito con nonmalignant epitelio mammario 10. Analogamente, il blocco-β1 integrine in cellule di carcinoma mammario non cambia il loro comportamento in condizioni standard di coltura, ma lo stesso esperimento condotto in colture 3-D dimostra che bloccare β1-integrina ritorna cellule maligne ad un fenotipo normale 11. Pertanto, microambiente tissutale non è necessaria solo per mantenere la vitalità cellulare, ma anche di mantenere corretta funzionalità delle cellule. Oltre a fornire un sistema in cui il comportamento delle cellule può essere studiato in condizioni fisiologiches, culture 3-D funzionano mezzo robusto e affidabile per la prova preclinica di nuove terapie 8,12,13. Coltura di cellule in 3-D permette lo screening di composti sperimentali nelle condizioni di ambiente mediata farmaco-resistenza 14, in cui potrebbe essere valutato il contributo di cellula-cellula e cellula-ECM adesione. Inoltre, la tossicità fuori bersaglio di nuovi composti può essere accertata incorporando diversi compartimenti cellulari di vari tessuti. Tali schermi possono essere eseguite più rapidamente e sono più conveniente rispetto gli studi comparabili in vivo 8. Qui vi presentiamo un impostazione di un modello 3-D di midollo osseo ricostruito (RBM), dove normale e maligna del midollo osseo (BM), le cellule proliferano ex vivo in un sistema mimando il microambiente del BM umana. Precedenti tentativi di crescita delle cellule umane primarie BM nelle culture 2-D, liquido o co-colture aderenti con i vari componenti della BM stroma, O 3-D, culture agar semisolido hanno avuto un successo limitato a causa della loro incapacità di fornire le cellule con i componenti del tessuto microambiente 15-18. In questi sistemi cellule midollari primarie hanno avuto scarsa vitalità e non è riuscito a proliferare ex vivo. Un altro sistema in cui le cellule progenitrici midollari umane sono coltivate in co-colture sferoidali con cellule stromali BM è un sistema 3-D in cui è stata sostenuta vitalità e la proliferazione di cellule staminali per almeno 96 ore 19. Tuttavia, anche se di grande beneficio per la comprensione della biologia progenitrici ematopoietiche, questo sistema non fedelmente ricapitolare il microambiente del BM per l&#39;assenza di componenti ECM, pertanto, limitando la sua utilità. Il modello RBM qui descritta presenta un sistema completo in cui entrambi i compartimenti cellulari ed extracellulari della BM umano sono ricostruiti in vitro. Abbiamo dimostrato che le culture meccanismi in grado di supportare la crescita ex vivo di cellule normali BM umane, come abbiamoll come cellule isolate da pazienti con vari disturbi ematologici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

Coltura di tessuti è stato uno strumento prezioso per studiare molti aspetti della funzione delle cellule, dallo sviluppo normale della malattia. Metodi di coltura cellulare convenzionali si basano sulla capacità delle cellule sia per legarsi a un substrato solido di un piatto di coltura di tessuti o di crescere in sospensione in mezzo liquido. Diverse linee cellulari immortali sono stati creati e coltivati ​​con tali approcci, tuttavia, questi metodi spesso falliscono quando le cellule primarie devono essere coltivate ex vivo. Tale guasto è stato attribuito alla mancanza dei componenti della matrice extracellulare appropriate del microambiente tessuto dai sistemi standard dove coltura tissutale di plastica è usato come superficie per la crescita cellulare. Matrice extracellulare è parte integrante del microambiente tissutale e la sua presenza è essenziale per il mantenimento delle funzioni fisiologiche come polarizzazione delle cellule, la sopravvivenza e la proliferazione. Qui vi presentiamo un metodo di coltura di tessuto a 3 dimensioni in cui il midollo osseo primario celLS sono cresciuti in matrice extracellulare formulato ricapitolare il microambiente dell&#39;osso umano (sistema RBM). Incorporato nella matrice extracellulare, cellule ricevono sostanze nutritive attraverso il mezzo supplementato con plasma umano, fornendo così un sistema completo in cui la sopravvivenza e la proliferazione cellulare possono essere mantenuti fino a 30 giorni, mantenendo la composizione cellulare del tessuto primario. Utilizzando il sistema RBM siamo cresciuti con successo le cellule del midollo osseo primarie da donatori sani che in pazienti con amiloidosi, e varie neoplasie ematologiche. Il sistema RBM permette, visualizzazione diretta in matrice tempo reale del comportamento delle cellule e la valutazione di efficacia preclinica di nuove terapie. Inoltre, le cellule possono essere isolate dal MLF e successivamente utilizzati per trapianto in vivo, selezione cellulare, citometria a flusso, e acido nucleico e proteina analisi. Nel loro insieme, il metodo RBM fornisce un sistema affidabile per la crescita di ossa primario Marrow cellule in condizioni fisiologiche.

Poiché le cellule del midollo osseo primario non riescono a proliferare in condizioni di coltura tissutale standard, il sistema di meccanismo è stato creato per imitare strettamente microambiente dell&#39;osso, fornendo un sistema di coltura ed espandere cellule BM ex vivo. I principali componenti della matrice extracellulare BM, fibronectina, collagene I, collagene IV, laminina e 21, sono state incorporate nella matrice meccanismi per fornire l&#39;impalcatura strutturale di questa cultura 3-D. En...

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A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Nei metodi standard di coltura le cellule sono presi dal loro ambiente fisiologico e cresciute sulla superficie di plastica di un piatto. Per studiare il comportamento delle cellule primarie midollo osseo umano è stato creato un sistema di coltura 3-D in cui le cellule sono coltivate in condizioni riassumono il microambiente nativo del tessuto.

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.6K Views.  Purdue University.  Nei metodi standard di coltura le cellule sono presi dal loro ambiente fisiologico e cresciute sulla superficie di plastica di un piatto. Per studiare il comportamento delle cellule primarie midollo osseo umano è stato creato un sistema di coltura 3-D in cui le cellule sono coltivate in condizioni riassumono il microambiente nativo del tessuto. 

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Ricerca

Medicina

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Cultura primario di Human vestibolare Schwannomi

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ROM is called a joint contracture and results in increased morbidity. Due to the difficulty of reversing established knee contractures, early detection is important, and hence, knowing risk factors for their development is essential. The rat represents a good model with which the effect of an intervention can be studied due to the similarity of rat knee anatomy to that of humans, the rat's ability to tolerate long durations of knee immobilization in flexion, and because mechanical data can be correlated with histologic and biochemical analysis of knee tissue.
Using an automated arthrometer, we demonstrate a validated, precise, reproducible, user-independent method of measuring the extension ROM of the rat knee joint at specific torques. This arthrometer can be used to determine the effects of interventions on knee joint ROM in the rat.

The goal of the protocol is to measure the extension range of motion of the rat knee. The effects of various diseases that increase the stiffness of the knee joint and the effectiveness of treatments can be quantified.

Utilizzando un ginocchio Kt1000 per valutare tessuto-specifici contributi alla contrattura della flessione del ginocchio nel ratto

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ...