Questa indagine è stata supportata dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) del National Institutes of Health (NIH) con il numero 1R01HL149404-01A1 (BL) e dal Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 HL 007936 all'Università del Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (JB). Le figure sono state create o modificate con Biorender.com. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 10.

Valutazione dello sviluppo dell'aneurisma aortico nei topi dopo il trattamento con elastasi

<ol>
	<li>Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Abdominal+aortic+aneurysms.">Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms.</a> New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).</li><li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Society+for+Vascular+Surgery+Guidelines+on+the+management+of+aorto-iliac+abdominal+aortic+aneurysms.">European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms.</a> Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).</li><li>Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cellular+immune+responses+in+abdominal+aortic+aneurysms.">Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).</li><li>Shen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+aneurysms+and+dissections+series.">Aortic aneurysms and dissections series.</a> ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).</li><li>Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Therapy+in+Vascular+and+Endovascular+Surgery+E-Book.">Current Therapy in Vascular and Endovascular Surgery E-Book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2014).</li><li>Morgan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+novel+mechanisms+of+abdominal+aortic+aneurysm+via+unbiased+proteomics+and+systems+biology.">Identifying novel mechanisms of abdominal aortic aneurysm via unbiased proteomics and systems biology.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 889994 (2022).</li><li>Yin, L., Kent, E. W., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+murine+models+of+ruptured+abdominal+aortic+aneurysm.">Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 950018 (2022).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chronic+advanced+stage+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model.">A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model.</a> J Vasc Surg. 66 (1), 232-242 (2017).</li><li>Berman, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+aortic+aneurysm+severity+and+growth+depend+on+topical+elastase+concentration+and+lysyl+oxidase+inhibition.">Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition.</a> Sci Rep. 12 (1), 99 (2022).</li><li>Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm</a> (2015)</li><li>Dansey, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endovascular+and+open+repair+for+abdominal+aortic+aneurysms+in+the+United+States+from+2004+to+2015+and+implications+for+screening.">Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening.</a> J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).</li><li>Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysms.">Mouse models of abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).</li><li>Busch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysm+to+the+translational+needs+of+vascular+surgery.">Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery.</a> JVS Vasc Sci. 2, 219-234 (2021).</li><li>Anidjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats.">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).</li><li>Bhamidipati, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+murine+model+of+aortic+aneurysms+using+peri-adventitial+elastase.">Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase.</a> Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).</li><li>Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model+induced+by+perivascular+application+of+elastase.">Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase.</a> J Vis Exp. (180), e63608 (2022).</li></ol>

Gli autori di questo manoscritto non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Comprendere la complessa fisiopatologia dell'AAA è fondamentale per migliorare la gestione della malattia da aneurisma aortico. Mentre le nuove strategie vengono sviluppate attivamente per migliorare i risultati chirurgici, gli AAA rimangono prevalenti nella nostra società che invecchia e la rottura dell'aneurisma rimane una delle principali cause di morte negli Stati Uniti10. Pertanto, le esigenze insoddisfatte nelle strategie di rilevamento, prevenzione e trattamento dell'AAA giustificano ulteriori ricerche fondamentali sull'aneurisma11.
I modelli animali che ricapitolano in modo accurato ed efficiente le caratteristiche e i comportamenti degli AAA umani sono essenziali per gli studi meccanicistici della fisiopatologia dell'aneurisma e per l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici. Mentre gli attuali modelli animali possono imitare gli aspetti principali dei cambiamenti aneurismatici che si verificano nelle malattie umane, nessun singolo modello rappresenta pienamente la vera complessità degli AAA umani. Attualmente, i topi sono la specie più ampiamente accettata per la modellazione animale AAA. I ricercatori dovrebbero considerare i vari punti di forza e di debolezza di ciascun modello murino per il loro particolare studio sull'aneurisma, come quelli sapientemente descritti nelle revisioni di Daugherty et al. e Busch et al.12,13.
L'uso dell'elastasi per indurre l'AAA nei roditori è stato descritto per la prima volta da Anidjar et al. nel 199014. La perfusione dell'aorta con l'elastasi pancreatica suina utilizzando una pompa a siringa crea una dilatazione iniziale all'incirca tra il 50% e il 70% e i segmenti dilatati dimostrano favorevolmente caratteristiche patologiche simili agli AAA umani, come la degenerazione mediale e l'infiammazione avventiziale. Il modello di perfusione classico, tuttavia, è probabilmente il modello di aneurisma tecnicamente più impegnativo e gli aneurismi che si formano tipicamente entro la seconda settimana iniziano a risolversi gradualmente in seguito. Bhamidipati et al. nel 2012 hanno poi dimostrato che l'applicazione avventiziale di elastasi potrebbe anche indurre con successo aneurismi simili che sono più riproducibili nella taglia15. Un modello molto meno impegnativo, il modello topico dell'elastasi è stato ampiamente adottato nella ricerca sull'aneurisma. Ulteriori metodologie e vantaggi del modello topico dell'elastasi sono discussi nell'articolo sui metodi di Xue e colleghi16.
Il modello elastasi/BAPN dell'AAA murino è stato sviluppato da Lu e colleghi nel 20178. L'introduzione di acqua potabile BAPN allo 0,2% ha migliorato molte delle critiche al classico modello topico dell'elastasi, producendo ora aneurismi che si espandono continuamente fino al punto di rottura dell'AAA. Nel loro studio del 2017, hanno dimostrato che i topi nel gruppo trattato con elastasi/BAPN avevano tassi di formazione di AAA significativamente più elevati rispetto al gruppo elastasi (93% vs 65%, P < 0,01), che erano anche AAA in stadio più avanzato. Per un periodo di studio di 100 giorni, gli AAA nel gruppo elastasi/BAPN hanno continuato a dilatarsi fino a raggiungere il >800% del diametro basale e hanno formato trombi intraluminali (53,8%) e il 46,2% si è rotto spontaneamente prima della fine dell'esperimento. Questo modello ha permesso ai ricercatori di studiare i fattori che possono influire sulla progressione e sulla stabilità dell'aneurisma nel tempo.
Berman et al. hanno ulteriormente esplorato il modello elastasi/BAPN variando la concentrazione di elastasi topica, la durata dello studio, i tempi di somministrazione di BAPN e l'impatto del sesso animale9. Il trattamento con 5 μL di elastasi concentrata più elevata (5 mg/mL o 10 mg/mL) ha prodotto aneurismi più grandi di 2,5 mg/mL in 56 giorni. La prevalenza della formazione di trombi intraluminali dipendeva anche dalla concentrazione di elastasi, che si è verificata nel 28,6% dei topi trattati con 5 mg/mL e nel 62,5% dei topi trattati con 10 mg/mL. Hanno anche dimostrato che il modello elastasi/BAPN potrebbe indurre aneurismi nei topi femmina. Sebbene siano stati studiati solo pochi topi femmina (n = 5), hanno scoperto che gli aneurismi nelle femmine erano più inclini alla rottura (2 su 5 topi) ed erano significativamente più grandi degli AAA maschi a 56 giorni.
In questo articolo, miriamo a fornire un metodo per affrontare uno dei maggiori limiti della modellazione chirurgica, che è la variazione nella procedura chirurgica. Senza un chiaro consenso sul grado di dissezione e sull'area dell'aorta trattata con elastasi, i risultati di questo modello potrebbero variare notevolmente tra animali, ricercatori e istituzioni. Abbiamo osservato numerose variazioni anatomiche tra i topi, tra cui il numero e le dimensioni delle arterie e delle vene lombari e la posizione dell'IMA, il decollo della vena gonadica sinistra, tra gli altri, che possono essere limitanti quando si tenta di trattare solo una porzione o un segmento specifico dell'aorta infrarenale. Qui, dimostriamo che sezionare circonferenzialmente l'intera lunghezza dell'aorta infrarenale dall'arteria renale sinistra prossimalmente alla biforcazione aortica distalmente aiuta a fornire gradi riproducibili di esposizione aortica nonostante le differenze anatomiche, aumentando al contempo il successo dell'induzione dell'aneurisma e fornendo confini chiari per l'operatore. Inoltre, le dimensioni e la posizione più anteriore dell'IVC tendono a coprire la maggior parte dell'aorta, il che può influenzare la quantità di aorta trattata se non isolata dall'IVC. Sebbene sia necessario rimuovere la fascia retroperitoneale per esporre l'aorta, è importante non sezionare completamente il tessuto connettivo dell'avventizia dall'aorta ed esporre uno qualsiasi degli strati multimediali, poiché ciò provoca tipicamente la rottura durante il periodo di incubazione dell'elastasi di 5 minuti. Questo potrebbe servire come un ulteriore controllo interno al grado di dissezione con questo modello, ma può essere una curva di apprendimento frustrante quando si adotta questo modello. Gli operatori impareranno inoltre le aree a rischio più elevato (Figura 4) che possono essere facilmente ferite durante l'intervento chirurgico e portare a un'emorragia incontrollabile.
Sebbene sia importante che le fasi procedurali di questo modello siano coerenti, la durata dello studio e la tempistica dell'ecografia a intervalli possono variare a seconda dell'obiettivo della ricerca. La dilatazione aortica inizia immediatamente con l'applicazione di elastasi, ma gli studi che utilizzano questo modello seguono comunemente i topi per 28 giorni dopo l'interventochirurgico 7, come in questo esperimento di esempio. L'estensione della durata dello studio deve essere presa in considerazione quando si studiano AAA avanzati, crescita a lungo termine, formazione di trombi intraluminali o rottura.
Ulteriori misure perioperatorie, come il mantenimento della temperatura corporea e dello stato di idratazione dell'animale, possono aiutare a migliorare la sopravvivenza degli animali di questa procedura invasiva. L'uso di un termoforo durante l'intervento chirurgico e il posizionamento in una gabbia di recupero calda può aiutare a evitare l'ipotermia. La soluzione salina deve essere riscaldata prima di essere utilizzata per irrigare la cavità addominale. Un bolo di liquido sottocutaneo subito dopo l'intervento chirurgico può spiegare perdite di liquidi insensibili durante l'operazione e aiutare l'animale a mantenere un'adeguata idratazione durante l'immediata fase di recupero. Con un'attenta manipolazione dei tessuti e un approccio metodico coerente, il modello elastasi/BAPN può essere eseguito da un operatore esperto tra i 30 e i 45 minuti per topo e produrre in modo affidabile AAA con complicanze perioperatorie molto basse.
I nostri risultati dimostrano che la combinazione di BAPN in aggiunta alla dissezione circonferenziale dell'aorta infrarenale prima dell'applicazione dell'elastasi produce AAA grandi e in continua espansione, con diametri maggiori e incidenza di rottura in periodi più brevi. In questo esperimento, gli AAA sono stati indotti con successo in tutti i topi maschi (6 su 6) e femmine (6 su 6) trattati con elastasi attiva. L'esposizione all'elastasi per 5 minuti ha provocato un aumento immediato del diametro aortico di circa il 30-40%, il che è utile per confermare il successo e la coerenza dell'applicazione dell'elastasi tra i gruppi di trattamento. Analogamente a Berman et al., abbiamo dimostrato che questo modello può indurre AAA nei topi femmine, che hanno anche una risposta di rottura maggiore rispetto ai maschi. La metà dei topi femmina (3 su 6) si è rotta entro 28 giorni, rispetto a 0 su 6 dei maschi, tuttavia, i topi femmine pesano meno dei maschi. I topi maschi hanno dimostrato un aumento del diametro dell'AAA del 257% rispetto al -4% dei controlli maschi, mentre le femmine sopravvissute hanno mostrato un aumento del diametro del 417%, rispetto al -16% dei controlli femmine. I diametri aortici non erano significativamente diversi tra i topi maschi e femmine sopravvissuti trattati a 28 giorni a causa del maggior numero di rotture nel gruppo femminile. Ipotizziamo che i topi fittizi mostrino diametri aortici più piccoli entro la fine dello studio, poiché l'aorta tende a dilatarsi leggermente durante la dissezione iniziale e quindi forma tessuto cicatriziale entro 28 giorni.
Il modello elastasi/BAPN presenta alcune limitazioni. La dissezione circonferenziale dell'aorta richiede competenze chirurgiche fini, ma aiuta a migliorare la replicabilità e il grado di induzione dell'aneurisma. Simile al modello topico dell'elastasi, c'è anche un effetto batch nell'attività dell'enzima elastasi, che, come accennato in precedenza, è quindi importante per utilizzare lo stesso flacone di elastasi per tutti gli animali in un determinato esperimento. Sebbene l'incidenza del trombo intraluminale AAA e della rottura aumenti con il tempo e la gravità dell'aneurisma, questi non sono garantiti né completamente prevedibili in questo modello.
In sintesi, il modello elastasi/BAPN produce grandi AAA infrarenali reali sia nei topi maschi che nelle femmine, che si espandono progressivamente nel tempo, formano trombi intraluminali e sono in grado di rompersi. Questi punti di forza di questo modello murino aiutano a ricapitolare meglio alcuni dei comportamenti e delle caratteristiche degli aneurismi nell'uomo. Sebbene tecnicamente difficile, un'attenta e completa dissezione dell'aorta può aumentare la risposta aneurismatica. Attualmente, il metodo elastasi/BAPN è un modello avanzato per lo studio degli aneurismi dell'aorta addominale infrarenale.

Un aneurisma è definito come una dilatazione patologica di un vaso sanguigno superiore al 50% del diametro del vaso sano1. Nonostante gli aneurismi dell'aorta addominale (AAA) siano una condizione comunemente riscontrata nella popolazione anziana, con un'incidenza di circa il >5% dei maschi > i 65 anni di età, non esistono strategie terapeutiche dirette per il trattamento dell'AAA1. L'attuale trattamento dell'AAA è limitato alla riduzione dei fattori di rischio e alla riparazione chirurgica con chirurgia a cielo aperto o endovascolare in base al diametro aortico o al tasso di crescita2. Il pericolo maggiore di AAA è la rottura di un aneurisma, che è fatale se non trattata, e la riparazione in questo contesto emergente può comportare rischi di mortalità fino al 90%1.
La fisiopatologia dell'AAA è complicata, multifattoriale e non completamente compresa3. Le caratteristiche dell'AAA umano includono la vera dilatazione aneurismatica della parete aortica con un'infiltrazione di cellule infiammatorie, la presenza di trombi intraluminali e la dilatazione progressiva che porta alla rottura finale 3,4. Inoltre, gli AAA sono associati all'età avanzata, hanno una predominanza sessuale maschio/femmina di 9:1 e si verificano più comunemente nell'aorta infrarenale5. Modellare tutte le caratteristiche e i comportamenti degli AAA umani negli animali rimane una sfida continua6.
L'attuale modellazione dell'AAA è condotta principalmente nei topi e gli aneurismi sono comunemente indotti utilizzando uno dei tre metodi: mediante infusione di angiotensina II (AngII) tramite una pompa osmotica impiantata per via sottocutanea e mediante applicazione diretta di cloruro di calcio (CaCl2) o elastasi all'aorta7. In quest'ultimo metodo, l'elastasi pancreatica suina (PPE) viene applicata a un segmento dell'aorta infrarenale e provoca la degradazione enzimatica delle fibre di elastina all'interno della lamella elastica della tunica media. Questo danno strutturale provoca l'indebolimento della parete aortica e la dilatazione aneurismatica verso l'esterno. L'uso della sola elastasi topica, tuttavia, produce aneurismi infrarenali relativamente piccoli, che non riescono ad allargarsi o rompersi progressivamente nel tempo. Più recentemente, Lu et al. hanno migliorato questo modello somministrando inoltre β-aminopropionitrile (BAPN), un inibitore irreversibile della lisil ossidasi, ai loro topi trattati con elastasi8. Impedendo la reticolazione delle fibre di elastina e collagene, l'integrazione di BAPN provoca la progressiva dilatazione delle aorte danneggiate dall'elastasi fino al punto di rottura. Il modello elastasi/BAPN ha inoltre un tasso di incidenza più elevato di AAA rispetto al modello di elastasi topica e gli aneurismi prodotti sono anche più grandi e contengono trombo intraluminale8.
Nel modello elastasi/BAPN, il grado di dissezione chirurgica e l'esposizione dell'aorta all'elastasi possono influire sul successo e sulla replicabilità di questo modello. In questo manoscritto, descriviamo che la co-somministrazione di acqua potabile BAPN e l'applicazione topica di elastasi all'aorta dopo l'isolamento circonferenziale dell'intero segmento aortico infrarenale migliora la replicabilità, tiene conto delle differenze anatomiche tra gli animali e si traduce in un maggiore tasso di induzione di AAA, dimensioni dell'aneurisma e incidenza di rotture. In questo articolo, descriveremo un approccio standardizzato per indurre in modo affidabile aneurismi dell'aorta addominale avanzata nei topi utilizzando una combinazione di acqua integrata con elastasi topica e BAPN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 L induction chamber</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0530XXS</td>
			<td>anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-03</td>
			<td>normal saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309569</td>
			<td>syringe, 22 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>A0796</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3134-25G</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avant Delux gauze sponges, 2&#34; x 2&#34; 4-Ply</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON26224</td>
			<td>gauze sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balding clipper</td>
			<td>Whal Clipper Corporation</td>
			<td>8110</td>
			<td>hair clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)</td>
			<td>Avrio</td>
			<td>NCD 67618-154-16</td>
			<td>betadine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td>blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine ER-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>BERLAB0.5</td>
			<td>buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-131-11</td>
			<td>carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO 5.75&#34; straight with lock</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>Castroviejo needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton tipped wood applicators, 6&#34;</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>No. 4302</td>
			<td>cotton tipped wood applicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESMARRES 5.5&#39; rectractor&#160;</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6672</td>
			<td>skin rectractor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital caliper, 0-150 mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td>digital caliper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase from porcine pancrease Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1250-10MG</td>
			<td>elastase &#62;4.0 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td>ethanol diluted to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye lube</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>14716</td>
			<td>eye lube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 dry sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>dry bead sterilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy mat</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>V016</td>
			<td>heat therapy mat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy pump</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>HTP-1500</td>
			<td>heat therapy pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>NCD 59399-106-01</td>
			<td>isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-10 pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>LTS 0.5-10 uL</td>
			<td>pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile anesthesia mask, small</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td>anesthesia nose cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro dissector scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5619</td>
			<td>micro dissector scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light</td>
			<td>Nikon Instruments, Inc</td>
			<td>83359 NII-LED</td>
			<td>external dissection light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-661-V</td>
			<td>5-0 nylon suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5</td>
			<td>Ansell</td>
			<td>20685975</td>
			<td>non-latex surgical gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 mm stainless steel wound clips</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>203-1000</td>
			<td>wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Compass CR2200</td>
			<td>scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnofFlo Accessory Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>10-8000-71</td>
			<td>tubing for electronic vaporizer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoFlo electronic vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SF2992</td>
			<td>low-flow electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoPath Flow Diverter</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SP1016</td>
			<td>flow diverter for electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS/45 sharp forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-4941</td>
			<td>sharp forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6010SC</td>
			<td>surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vessel forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>VES 0.35</td>
			<td>vessel forceps</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced abdominal aortic aneurysm modeling in mice by combination of topical elastase and oral &#223;-aminopropionitrile

Il modello murino topico di elastasi dell'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è potenziato se combinato con acqua potabile integrata con ß-aminopropionitrile (BAPN) per produrre in modo affidabile veri aneurismi infrarenali con comportamenti che imitano gli AAA umani. L'applicazione topica di elastasi all'avventizia dell'aorta infrarenale provoca un danno strutturale agli strati elastici della parete aortica e avvia la dilatazione aneurismatica. La co-somministrazione di BAPN, un inibitore della lisil ossidasi, promuove la degenerazione prolungata della parete riducendo la reticolazione di collagene ed elastina. Questa combinazione si traduce in grandi AAA che si espandono progressivamente, formano trombi intraluminali e sono in grado di rompersi. Il perfezionamento delle tecniche chirurgiche, come l'isolamento circonferenziale dell'intero segmento aortico infrarenale, può aiutare a standardizzare la procedura per un'applicazione coerente e completa dell'elastasi pancreatica suina nonostante i diversi operatori e le variazioni anatomiche tra i topi. Pertanto, il modello elastasi/BAPN è un approccio raffinato per indurre chirurgicamente l'AAA nei topi, che può ricapitolare meglio gli aneurismi umani e fornire ulteriori opportunità per studiare la crescita dell'aneurisma e il rischio di rottura.

In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J maschi e femmine di età compresa tra 22 e 24 settimane. Le aorte infrarenali sono state trattate con 5 μL di enzima elastasi (6,9 mg di proteine/mL, 6 unità/mg di proteine) o elastasi denaturata per 5 minuti. I topi maschi trattati con elastasi hanno dimostrato un aumento del 43,4% del diametro aortico dopo 5 minuti di esposizione all'elastasi rispetto ai diametri aortici basali non trattati, mentre le aorte femminili trattate sono aumentate del 33,6% (P = 0,0342). I diametri aortici delle simore non hanno mostrato variazioni relativamente nulle nell'arco di 5 minuti di esposizione all'elastasi denaturata (maschi 0,5%; femmine -2,8%). Non ci sono stati decessi correlati chirurgicamente tra i 12 topi trattati e i 6 topi fittizi. I dati per lo studio di 28 giorni sono dimostrati nella Tabella 1. Delle femmine di topo trattate, 3 su 6 sono morte per rottura dell'AAA; uno il giorno 20 postoperatorio e due il giorno 25 (Figura 6). Non ci sono state rotture AAA tra i maschi trattati. Gli AAA (definiti come un aumento >50% del diametro dell'aorta basale o la morte per rottura dell'AAA) sono stati indotti con successo in tutti i topi trattati (12 su 12). A 28 giorni, il diametro medio AAA dei maschi trattati era di 2,86 ± 0,31 mm, con una variazione percentuale media di 257 ± 54%, mentre i diametri AAA delle femmine sopravvissute di topi trattati erano 3,60 ± 1,87 mm, con una variazione percentuale media di 417 ± 286% (Figura 7). I topi fittizi non hanno mostrato relativamente alcun cambiamento nei diametri aortici.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig06.jpg"> Figura 6: Sopravvivenza di topi B6 maschi e femmine durante un modello di AAA con elastasi/BAPN di 28 giorni. (A) La rottura dell'AAA si è verificata in 3 dei 6 topi femmina trattati (un topo a 20 giorni, poi due topi a 25 giorni) mentre non ci sono state rotture tra i 6 topi maschi trattati a 28 giorni. (B) Immagini rappresentative all'autopsia di una femmina di topo morta per rottura di AAA. La rottura dell'AAA è dimostrata da un grande ematoma retroperitoneale (a sinistra) e dalla presenza di un AAA infrarenale con un difetto di parete (a destra). Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig07.jpg"> Figura 7: Diametri aortici massimi di elastasi/BAPN e topi B6 maschi e femmine fittizi a 28 giorni. (A) I topi trattati mostrano diametri infrarenali significativamente più grandi a 28 giorni rispetto agli sham. (B) La combinazione di elastasi e BAPN produce con successo grandi AAA infrarenali sia nei topi B6 maschi che in quelli femmine. Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"></td>
			<td>86 maschio Sham</td>
			<td>86 femmina Sham</td>
			<td>86 Elastasi maschile/8APN</td>
			<td>86 Elastasi femmina/8APN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Numero di topi</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Età (settimane)</td>
			<td>22,3 ± 0,0</td>
			<td>22,7 ± 0,7</td>
			<td>23,1 ± 0,2</td>
			<td>23,2 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Peso (g; all'intervento chirurgico)</td>
			<td>36,3 ± 2,5</td>
			<td>23,7 ± 1,2</td>
			<td>32,8 ± 1,7*</td>
			<td>23,7 ± 0,8</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diametro aortico pre-trattamento (mm)</td>
			<td>0,89 ± 0,02</td>
			<td>0,75 ± 0,04</td>
			<td>0,81 ± 0,07</td>
			<td>0,73 ± 0,09</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diametro aortico post-trattamento (mm)</td>
			<td>0,90 ± 0,03</td>
			<td>0,73 ± 0,01</td>
			<td>1,15 ± 0,03**</td>
			<td>0,98 ± 0,12**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Variazione percentuale dopo 5 minuti di trattamento (%)</td>
			<td>0,5 ± 4,4</td>
			<td>-2,8 ± 5,3</td>
			<td>43,4 ± 10,2***</td>
			<td>33,6 ± 4,5***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incidenza AAA (%)</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>6 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">AAA si rompe di 28 giorni</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Sopravvivenza a 28 giorni</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diametro aortico massimo a 28 giorni (mm)</td>
			<td>0,85 ± 0,01</td>
			<td>0,64 ± 0,01</td>
			<td>2,86 ± 0,31*</td>
			<td>3,60 ± 1,87**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Variazione percentuale del diametro aortico a 28 giorni (%)</td>
			<td>-4 ± 2</td>
			<td>-16 ± 2</td>
			<td>257 ± 54*</td>
			<td>417 ± 286**</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Risultati di un modello murino a 28 giorni di elastasi/BAPN di AAA. I dati sono medi ± SD. *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0001 rispetto a sham dello stesso sesso tramite il test di Fischer ANOVA a una via. Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale.

Autore in primo piano: Modello AAA murino potenziato che utilizza l'elastasi per imitare gli aneurismi umani

Questo protocollo descrive un approccio chirurgico metodico per modellare gli aneurismi dell'aorta addominale avanzata nei topi mediante una combinazione di applicazione diretta di elastasi all'aorta infrarenale e somministrazione di ß-aminopropionitrile attraverso l'acqua potabile.

Modellazione avanzata dell'aneurisma dell'aorta addominale nei topi mediante combinazione di elastasi topica e ß-aminopropionitrile orale

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Advanced Abdominal Aortic Aneurysm Modeling in Mice by Combination of Topical Elastase and Oral &#223;-aminopropionitrile

1.1K Views.  University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health. La nostra ricerca mira a comprendere la fisiopatologia dell'aneurisma dell'aorta addominale. In particolare, ci piace sapere in termini molecolari come si rompe l'aneurisma. Crediamo che modellare l'aneurisma aortico nei topi, maschi e femmine, ci aiuterà a sviluppare un nuovo trattamento per questa malattia altamente letale che necessita urgentemente di un trattamento farmacologico.La fisiopatologia dell'aneurisma dell'aorta addominale è multifattor...

Video: Autore in primo piano: Modello AAA murino potenziato che utilizza l'elastasi per imitare gli aneurismi umani

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase 

Transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta is the most widely used animal model of abdominal aortic aneurysm (AAA) ever since it was first described in rats by Anidjar and colleagues.1 The rationale for its development was based on the disrupted nature of elastin observed in AAAs. This rat model has been modified to produce AAAs in the infrarenal aortic region of mice.2 The model has the ability to add broad insight into the pathobiology of AAA due to the emergence of numerous transgenic and gene knockout mice. Moreover, it is a viable platform to test potential therapeutic agents for AAA. In this video, we demonstrate the elastase infusion AAA procedure used in our laboratory. 
Mice are anesthetized using 2.5% isoflurane, and a laparotomy is performed under sterile conditions. The abdominal aortais isolated with the assistance of an operating stereomicroscope (Leica). After placing temporary ligatures around the proximal and distal aorta, an aortotomy is created at the bifurcation with the tip of a 30-gauge needle. A heat-tapered segment of PE-10 polyethylene tubing is introduced through the aortotomy and secured. The aortic lumen is subsequently perfused for 5-15 minutes at 100 mm Hg with saline containing type I porcine pancreatic elastase (4.5 U/mL; Sigma Chemical Co.). After removing the perfusion catheter, the aortotomy is repaired without constriction of the lumen.

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase

This video shows how to induce abdominal aortic aneurysms (AAA) in mice via transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta. The model has the ability to add broad insight into the pathobiology of AAA due to the emergence of numerous transgenic and gene knockout mice.

Creazione di Murine aneurismi dell&#39;aorta addominale Sperimentale con elastasi

Transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta is the most widely used animal model of ...

Ricerca

Biologia

Transverse Aortic Constriction in Mice

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart failure.1 TAC initially leads to compensated hypertrophy of the heart, which often is associated with a temporary enhancement of cardiac contractility. Over time, however, the response to the chronic hemodynamic overload becomes maladaptive, resulting in cardiac dilatation and heart failure.2 The murine TAC model was first validated by Rockman et al.1, and has since been extensively used as a valuable tool to mimic human cardiovascular diseases and elucidate fundamental signaling processes involved in the cardiac hypertrophic response and heart failure development. When compared to other experimental models of heart failure, such as complete occlusion of the left anterior descending (LAD) coronary artery, TAC provides a more reproducible model of cardiac hypertrophy and a more gradual time course in the development of heart failure. Here, we describe a step-by-step procedure to perform surgical TAC in mice. To determine the level of pressure overload produced by the aortic ligation, a high frequency Doppler probe is used to measure the ratio between blood flow velocities in the right and left carotid arteries.3, 4 With surgical survival rates of 80-90%, transverse aortic banding is an effective technique of inducing left ventricular hypertrophy and heart failure in mice.

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model to study mechanisms underlying cardiac hypertrophy and heart failure development. Here, we describe procedures to constrict the aorta to create a reproducible degree of cardiac hypertrophy in mice.

Aortica costrizione trasversale nei topi

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model Induced by Perivascular Application of Elastase

Abdominal aortic aneurysm (AAA), although primarily asymptomatic, is potentially life-threatening as the rupture of AAA usually has a devastating outcome. Currently, there are several distinct experimental models of AAA, each emphasizing a different aspect in the pathogenesis of AAA. The elastase-induced AAA model is the second most used rodent AAA model. This model involves direct infusion or application of porcine pancreatic elastase (PPE) to the infrarenal segment of the aorta. Due to technical challenges, most elastase-induced AAA model nowadays is performed with the external application rather than an intraluminal infusion of PPE. The infiltration of elastase will cause degradation of elastic lamellae in the medial layers, resulting in the loss of aortic wall integrity and subsequent dilation of the abdominal aorta. However, one disadvantage of the elastase-induced AAA model is the inevitable variation of how the surgery is performed. Specifically, the surgical technique of isolating the infrarenal segment of the aorta, the material used for aorta wrapping and PPE incubation, the enzymatic activity of PPE, and the time duration of PPE application can all be important determinants that affect the eventual AAA formation rate and aneurysm diameter. Notably, the difference in these factors from different studies on AAA can lead to reproducibility issues. This article describes a detailed surgical process of the elastase-induced AAA model through direct application of PPE to the adventitia of the infrarenal abdominal aorta in the mouse. Following this procedure, a stable AAA formation rate of around 80% in male and female mice is achievable. The consistency and reproducibility of AAA studies using an elastase-induced AAA model can be significantly enhanced by establishing a standard surgical procedure.

The present protocol describes a standardized surgical method for the elastase-induced AAA model through the direct application of elastase to the adventitia of infrarenal abdominal aorta in mice.

Modello di aneurisma dell'aorta addominale del topo indotto dall'applicazione perivascolare dell'elastasi

Abdominal aortic aneurysm (AAA), although primarily asymptomatic, is potentially life-threatening as the rupture of AAA usually has a devastating outcome. ...

A Modified Technique for Transverse Aortic Constriction in Mice

Transverse aortic constriction (TAC) is a frequently used surgery in research regarding heart failure and cardiac hypertrophy based on the formation of pressure overload in mouse models. The main challenge of this procedure is to clearly visualize the transverse aortic arch and precisely band the target vessel. Classical approaches perform a partial thoracotomy to expose the transverse aortic arch. However, it is an open-chest model that causes a rather large surgical trauma and requires a ventilator during the surgery. To prevent unnecessary trauma and simplify the operating procedure, the aortic arch is approached via the proximal proportion of the sternum, reaching and binding the target vessel using a small self-made retractor that contains a snare. This procedure can be conducted without entering the pleura cavity and does not need a ventilator or microsurgical operation, which leaves the mice with physiological breathing patterns, simplifies the procedure, and significantly reduces operation time. Due to the less invasive approach and less operation time, mice can undergo fewer stress reactions and recover rapidly.

The present protocol describes a modified and simplified technique with a minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) procedure using a self-made retractor. This procedure can be conducted without a ventilator or microscope and introduces pressure overload, eventually leading to cardiac hypertrophy or heart failure.

Una tecnica modificata per la costrizione aortica trasversale nei topi

Transverse aortic constriction (TAC) is a frequently used surgery in research regarding heart failure and cardiac hypertrophy based on the formation of ...

A Calcium Phosphate-Induced Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening cardiovascular disease that occurs worldwide and is characterized by irreversible dilation of the abdominal aorta. Currently, several chemically induced murine AAA models are used, each simulating a different aspect of the pathogenesis of AAA. The calcium phosphate-induced AAA model is a rapid and cost-effective model compared to the angiotensin II- and elastase-induced AAA models. The application of CaPO4 crystals to the mouse aorta results in elastic fiber degradation, loss of smooth muscle cells, inflammation, and calcium deposition associated with aortic dilation. This article introduces a standard protocol for the CaPO4-induced AAA model. The protocol includes material preparation, the surgical application of the CaPO4&#160;to the adventitia of the infrarenal abdominal aorta, the harvesting of aortas to visualize aortic aneurysms, and histological analyses in mice.

This protocol describes a calcium phosphate-induced abdominal aortic aneurysm (AAA) mouse model to study the pathological features and molecular mechanisms of AAAs.

Un modello di aneurisma dell'aorta addominale del topo indotto da fosfato di calcio

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening cardiovascular disease that occurs worldwide and is characterized by irreversible dilation of the ...