Quindi studiamo i carboidrati complessi, o glicani, nel sistema immunitario innato e nei disturbi immunocorrelati, concentrandoci attualmente sulla sepsi e sul cancro. Il nostro lavoro riguarda metodi analitici e sistemi di glicobiologia, inclusi i metodi di glicomica e glicoproteomica, per la caratterizzazione dettagliata della glicoproteina umana. La glicoproteomica ha registrato enormi progressi negli ultimi decenni e i progressi non sono più limitati dalla carenza di dati di spettrometria di massa di alta qualità disponibili.
Piuttosto, la sfida è quella di interpretare e generare conoscenze biologiche dai dati spettrali. Il metodo di glicoproteomica guidato dai gliomici consente agli scienziati del glico di ottenere una visione profonda e accurata del glicoproteoma e delle barriere dure con indici di salute umana, la glicoproteomica è in grado di generare informazioni specifiche del sito sul glicoproteoma. Ma i tassi di glicopeptidi rimangono elevati.
Per affrontare questi problemi di riproducibilità, il nostro metodo glicomico di glicoproteomica consente una profilazione precisa del glicoproteoma definendo i vincoli nello spazio di ricerca dei glicani attraverso l'indagine glicomica dello stesso campione. In definitiva, consente ricerche di glicopeptidi più rapide e accurate. Il nostro metodo di glicoproteomica guidato dai glifumetti consente una mappatura completa dell'eterogeneità e della dinamica degli indici del glicoproteoma da una varietà di diversi campioni umani.
Questo metodo può quindi aiutarci a comprendere meglio la progressione della malattia e può anche aiutarci a trovare nuovi biomarcatori diagnostici per bersagli terapeutici contro un'ampia varietà di malattie umane. Il metodo della glicoproteomica guidata dai gliomici ci consente di decifrare la complessità del glicoproteoma umano, che, a sua volta, apre nuove questioni biologiche come il modo in cui le strutture dei glicani influenzano la funzione proteica, la comunicazione cellulare o le risposte immunitarie. Solleva anche domande su come e perché il modello di glicosilazione sia cambiato in alcune malattie.
E queste intuizioni potrebbero portare a scoperte e nuovi marcatori diagnostici e terapie personalizzate in malattie complesse. Per immobilizzare la proteina di interesse su una membrana in PVDF, utilizzando una puntura a foro singolo, tagliare la membrana in base al numero di campioni da individuare. Bagnare le membrane asportate con metanolo, quindi trasferirle in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.
Una volta che le membrane sono quasi asciutte, applicare 2,5 microlitri di campioni di proteine per punto. Asciugare le membrane all'aria a 20-25 gradi Celsius per almeno tre ore, o preferibilmente durante la notte, facendo attenzione a evitare contaminazioni. Aggiungere 100 microlitri di PDP-40 all'1% in metanolo a ciascun pozzetto contenente le membrane maculate.
Agitare la piastra nella soluzione PDP-40 a 20-25 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, scartare la soluzione PDP-40. Successivamente, lavare ogni pozzetto contenente le macchie proteiche ostruite con 100 microlitri di acqua ultrapura e agitare la piastra per cinque minuti.
Aggiungere 15 microlitri di soluzione PNGase F a ciascun pozzetto. Per prevenire la disidratazione, aggiungere acqua ai pozzetti vuoti circostanti. Sigillare accuratamente la piastra con pellicola trasparente e incubare per almeno otto ore a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, sonicare la piastra per cinque minuti per aiutare le goccioline evaporate sui lati dei pozzetti a raccogliersi sul fondo. Trasferire i campioni di N-glicano rilasciati in singole provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Lavare ogni campione due volte con 20 microlitri di acqua ultrapura, aspirando e combinando tutti i campioni rimanenti nelle nuove provette.
Successivamente, aggiungere 10 microlitri di acetato di ammonio da 100 millimolari pH 5 e incubare i campioni per un'ora a 20-25 gradi Celsius. Essiccare i campioni di N-glicano in un sistema di concentrazione sottovuoto. Per preparare il carbonio di grafite porosa fatto in casa, o l'estrazione in fase solida PGC-C18, o le microcolonne SPE, utilizzare una siringa per collegare e trasferire i dischi C18 nei puntali delle pipette da 10 microlitri.
Pipettare 10 microlitri di impasto di resina PGC sospeso al 50% di metanolo nelle microcolonne C18 SPE. Posizionare le microcolonne in provette da 2 millilitri con adattatori per microcentrifuga. Ruotare i tubi per creare microcolonne PGC-C18 SPE con un'altezza approssimativa della colonna di 0,5 centimetri.
Successivamente, aggiungere 50 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%, o TFA, in acetonitrile nelle microcolonne e centrifugare a 2000 G per 60 secondi per facilitare il passaggio delle fasi mobili attraverso le microcolonne. Allo stesso modo, lavare e condizionare le microcolonne tre volte utilizzando TFA acquoso allo 0,1%. Applicare i campioni di N-glicano su ciascuna microcolonna in volumi di carico fino a 40 microlitri.
Centrifuga la microcolonna dopo ogni edizione, ripetendo fino a caricare l'intero campione. Lavare ogni microcolonna con 20 microlitri di acqua ultrapura. Trasferire le microcolonne in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Per eluire gli N-glicani, aggiungere 40 microlitri di TFA allo 0,1% in acetonitrile al 50% a ciascuna microcolonna. Girare i tubi e unire l'eluato di ogni centrifuga. Essiccare gli N-glicani dissalati in un sistema di concentratori sottovuoto.
Sfogliare i dati grezzi LC-MS/MS generati utilizzando il software appropriato. Conferma l'elevata qualità dei dati valutando l'ampiezza del picco LC stretta, l'efficace separazione degli isomeri N-glicani, l'elevata accuratezza MS, la risoluzione e il rapporto segnale/rumore, insieme all'elevata efficienza di frammentazione CID MS/MS. Identificare manualmente gli N-glicani nel campione in base alla massa del precursore monoisotopico, ai modelli di frammentazione CID MS/MS e ai tempi di ritenzione relativi e assoluti di PGC-LC.
Per la quantificazione relativa degli N-glicani, generare un elenco di transizione contenente il rapporto massa/carica del precursore monoisotopico per tutti gli isomeri N-glicani identificati. Determinare i valori dell'area sotto la curva dai cromatogrammi ionici estratti di tutti gli ioni precursori di N-glicani. Per preparare le microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE, utilizzando una siringa, collegare e trasferire i dischi C8 in puntali per pipette da 10 microlitri.
Depositare un impasto di resina ZIC-HILIC sospeso in metanolo nelle microcolonne C8-SPE. Posizionare le microcolonne in provette da 2 millilitri con adattatori per microcentrifuga, assicurandosi che le colonne siano sospese al centro. Rotazione per creare microcolonne HPLC C8-SPE con un'altezza approssimativa di un centimetro.
Aggiungere 50 microlitri di metanolo nelle microcolonne e centrifugare a 2000 G per 60 secondi, consentendo il passaggio delle fasi mobili attraverso la colonna. Allo stesso modo, lavare le microcolonne tre volte, ciascuna con 50 microlitri di acqua ultrapura seguiti da 50 microlitri di TFA all'1% in acetonitrile all'80%. Risospendere le miscele peptidiche essiccate destinate all'arricchimento di N-glicopeptidi in 50 microlitri di 1%TFA in 80% di acetonitrile e mescolare accuratamente.
Posizionare le microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE in nuove provette da 1,5 millilitri con adattatori per microcentrifuga. Applicare le miscele di peptidi risospesi su ciascuna microcolonna e centrifugare a 2000 G per 60 secondi. Raccogliere il flusso attraverso le frazioni e riapplicare ciascuna frazione alla stessa microcolonna ZIC-HILIC-C8-SPE.
Quindi eluire l'N-glicopeptide con l'aggiunta sequenziale di 50 microlitri di bicarbonato di ammonio da 25 millimolari e 50 microlitri di acetonitrile al 50%. Trasferire le microcolonne in nuove provette per microcentrifuga a basso legame da 1,5 millilitri. Per eluire in sequenza l'N-glicopeptide trattenuto, aggiungere 50 microlitri di TFA acquoso allo 0,1% nelle microcolonne e centrifugare a 2000 G per 60 secondi.
Quindi eluire l'N-glicopeptide con l'aggiunta sequenziale di 50 microlitri di TFA acquoso allo 0,1% seguiti da 50 microlitri di bicarbonato di ammonio da 25 millimolari e 50 microlitri di acetonitrile al 50%. Raccogliere, combinare ed essiccare gli N-glicopeptidi arricchiti e il flusso di peptidi non modificati attraverso frazioni in un sistema di concentrazione sotto vuoto. L'analisi dei dati N-glicomici ha identificato 76 isomeri N-glicani nei tessuti del cancro del colon-retto con il 70% di glicani complessi/ibridi, il 20% di oligomannosio e il 10% di paucimannosio.
Tutte le strutture di N-glicani sono state confermate con prove spettrali, quantificate utilizzando i valori dell'area sotto la curva dai cromatogrammi ionici estratti.
