La strategia di cromatografia a doppia funzionalità dell'affinità del metallo immobilizzato in titanio può arricchire sia N-glicopeptidi che fosfopeptidi nello stesso flusso di lavoro, aumentando le informazioni biomolecolari dalla stessa analisi. Il vantaggio principale di questo arricchimento sono due meccanismi di separazione, che consentono la separazione simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi in frazioni separate per l'analisi della spettrometria di massa a valle. L'utilizzo di questo metodo di arricchimento può migliorare il rilevamento della glicosilazione e della fosforilazione in campioni biologici complessi come i tessuti pancreatici verso la scoperta di biomarcatori di malattia come nel diabete e nel cancro.
Poiché questo metodo si basa su punte di centrifugazione e centrifugazione, è importante controllare la velocità di centrifugazione e assicurarsi che i campioni siano privi di particolato per evitare qualsiasi intasamento. Per iniziare, pre-raffreddare le parti del polverizzatore tissutale che verranno a contatto con i tessuti pancreatici, vale a dire la camera, il polverizzatore e il cucchiaio di recupero, insieme a eventuali spatole, in un contenitore di polistirolo. Quindi, trasferire i pezzi di tessuto nel supporto del campione pre-refrigerato e aggiungere un azoto liquido al tessuto fino a quando non sono congelati.
Dopo aver posizionato il polverizzatore nella camera, colpirlo usando un martello da cinque a dieci volte per schiacciare il campione, quindi rimuovere il polverizzatore dalla camera e raschiare via la polvere di tessuto aderente e pezzi. Quindi, aggiungere un cucchiaio di azoto liquido alla camera se i tessuti iniziano a sciogliersi e ripetere il processo di polverizzazione fino a ottenere una polvere fine e porzionare i campioni in aliquote di circa 100 milligrammi in tubi pre-refrigerati. Dopo aver preparato il tampone di lisi, sciogliere una compressa ciascuna di proteasi e inibitore della fosfatasi in 500 microlitri di acqua, per una scorta di 20 volte la concentrazione finale desiderata, e aggiungere il volume richiesto di stock di ciascun inibitore al tampone di lisi per raggiungere le concentrazioni finali dell'inibitore.
Dopo aver aggiunto 600 microlitri di tampone di lisi al tubo, incubare a 95 gradi Celsius nel blocco riscaldante per 10 minuti con agitazione a 800 RPM, quindi rimuovere i campioni dal blocco riscaldante e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Successivamente, sonicare i campioni a 60 Watt di energia per 45 secondi, utilizzando impulsi di 15 secondi con un riposo di 30 secondi nel mezzo, e pellet i campioni a 3000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere il surnatante a cinque volte il suo volume di solvente per precipitazione.
Ad esempio, 300 microlitri di tampone di lisi a 1,5 millilitri di solvente per precipitazione contenente il 50% di acetone, il 49,9% di etanolo e lo 0,1% di acido acetico, quindi raffreddare durante la notte a 80 gradi Celsius. Pellet i campioni di nuovo a 3000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, e rimuovere il surnatante, quindi lavare il pellet rompendo con una spatola e mescolare con la stessa quantità di solvente per precipitazione. Dopo la centrifugazione, asciugare all'aria il pellet campione in una cappa aspirante per 15 minuti e conservare a 80 gradi Celsius fino al momento di procedere.
In primo luogo, sospendere nuovamente il pellet proteico in 300 microlitri di tampone di digestione appena prodotto contenente 50 millimolari tampone trietilammonio bicarbonato e otto urea molare. Alla proteina in soluzione, aggiungere il ditiotreitolo a una concentrazione finale di cinque millimolari, mescolare e ridurre a temperatura ambiente per un'ora, quindi aggiungere iodoacetamide a una concentrazione finale a 15 millimolare. Mescolare e alchilare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
Quindi, aggiungere Lys-C / Tripsina a 1 a 100 rapporto enzima-proteina e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore per quattro ore, quindi aggiungere 50 millimolmonio bicarbonato tampone per diluire l'urea otto molare utilizzata a meno di un molare. Dopo aver aggiunto tripsina a 1 a 100 rapporto enzima-proteina, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore durante la notte, successivamente spegnere la digestione con l'aggiunta di acido trifluoroacetico. Per ogni milligrammo di proteina di partenza, caricare una cartuccia di desalinizzazione con un millilitro di acetonitrile e tre volte con un millilitro di acido trifluoroacetico allo 0,1%, quindi caricare la miscela digerita sulla cartuccia di dissalazione e lavare la miscela tre volte usando un millilitro di acido trifluoroacetico allo 0,1%.
Successivamente, eluire i peptidi usando un millilitro di soluzione di acetonitrile al 60% e acido formico allo 0,1%, quindi asciugare i peptidi eluiti a circa 35 gradi Celsius usando un concentratore di vuoto centrifugo fino a quando il solvente non è completamente evaporato. Dopo aver risospendeto i peptidi in acqua, stimare le concentrazioni di peptidi utilizzando un test peptidico secondo il protocollo del produttore, quindi porzionare i peptidi in aliquote da 500 microgrammi e asciugare completamente. Pesare circa tre milligrammi di cotone idrofilo e imballarlo in una punta di centrifuga vuota.
Dopo aver trasferito un grammo di materiale per cromatografia di affinità metallica immobilizzata in titanio in un tubo, aggiungere lo 0,1% di acido trifluoroacetico a una concentrazione nota di materiale. Dopo aver aggiunto abbastanza liquame a una punta di centrifuga per trasferire 20 milligrammi di materiale, lavare la punta di centrifugazione centrifugando con 200 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%. Sospendere nuovamente i campioni in 200 microlitri di solvente di carico/lavaggio e scorrere attraverso la punta di centrifuga.
Dopo aver lavato la punta di centrifugazione mediante centrifugazione con solvente di carico/lavaggio, lavare la punta di centrifuga con 200 microlitri di soluzione di acido formico all'80% di acetonitrile 0,1, quindi eluire i peptidi con 200 microlitri di E1 ed E2 e analizzare ogni eluizione separatamente. Ripetere il processo di eluizione utilizzando solventi E3 ed E4 e combinare le frazioni di eluizione appropriate prima dell'analisi a valle. Prima di eseguire le eluizioni a pH di base, condizionare il materiale tre volte utilizzando 200 microlitri di acetonitrile al 90% in idrossido di ammonio al 2,5%, quindi eluire i peptidi con 200 microlitri di solventi E5 ed E6 e analizzare queste eluizioni separatamente dopo la dissalazione utilizzando una punta imballata.
Quindi, eluire i peptidi con 200 microlitri di diverse concentrazioni di acetonitrile e idrossido di ammonio. Successivamente, combinare queste eluizioni e analizzare come un unico campione, E7, dopo la dissalazione con una punta imballata. Spettri MS/MS annotati ad alta confidenza da peptidi N-glicosilati e fosforilati sono stati ottenuti con una ricca frammentazione dei precursori, aumentando la fiducia nell'identificazione, come assegnato dal software di ricerca del database.
Le identificazioni peptidiche sono state trovate da campioni arricchiti utilizzando il metodo a doppia funzionalità della cromatografia a cromatografia a simmetria metallica immobilizzata in titanio su ciascuna frazione di eluizione. La maggior parte dei glicopeptidi eluisce nelle prime quattro frazioni, mentre la maggior parte dei fosfopeptidi eluisce nelle ultime tre frazioni, diminuendo le potenziali interferenze nella ionizzazione. I risultati della glicoproteomica del metodo dual titanium sono stati confrontati con un arricchimento solo glicopeptide di Ehrlich, dimostrando che le proporzioni di ciascun tipo di glicano dopo il binning in sei categorie in base alla loro composizione, sono simili tra entrambi i metodi.
I risultati della fosfoproteomica del metodo dual titanium sono stati confrontati con un convenzionale arricchimento con cromatografia a cromatografia con affinità metallica immobilizzata solo con fosfopeptidi o utilizzando entrambi i metodi. La maggior parte degli amminoacidi fosforilati sono stati identificati come serina e treonina, con circa l'1% di tirosina fosforilata. Costruire correttamente la punta di rotazione è importante per garantire un'eluizione regolare.
Inserire saldamente il cotone nella punta, in modo che il materiale di arricchimento possa essere imballato sopra il cotone. Abbiamo utilizzato il metodo IMAC in titanio a doppio funzionalità per la caratterizzazione simultanea della glicosilazione e della fosforilazione nella maggior parte dei tessuti e della proteina spike SARS-CoV-2.
