ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

要約

遺伝子のマイクロアレイはゲノムワイドなレベルでの遺伝子発現プロファイリングの強力なツールです。この技術は、発生生物学や毒物学を含む生物学的な分野の様々なアプリケーションを持っています。このビデオでは、我々は詳細ゼブラフィッシュのための包括的なオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析用プロトコルを。

要約

遺伝子マイクロアレイ技術はゲノムワイドに転写レベルの定量的測定と遺伝子発現プロファイリングを可能にする。遺伝子マイクロアレイ技術は、疾患の状態への発達段階との関係でグローバルな遺伝子発現解析など、さまざまな用途で多くの生物学的分野、及び毒性応答で使用されています。ここで、我々は包括的なゼブラフィッシュ特異的オリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析のデモンストレーションが含まれています。ゼブラフィッシュの発現のマイクロアレイプラットフォームは、ターゲットごとに最大12のプローブと37157目標を問い合わせる385000プローブ、長さ60塩基対が含まれています。このプラットフォームでは、ゼブラフィッシュで使用可能なすべてのcDNAおよびゲノム情報は、Ensemblの（http://www.ensembl.org）、VEGA（http://vega.sanger.ac.uk）、UCSC（を含む様々なゲノムデータベースから収集されたhttp://genome.ucsc.edu）、およびZFIN（http://www.zfin.org）。その結果、この式の配列は、現在のゼブラフィッシュのトランスクリプトームの完全なカバレッジを提供します。ゼブラフィッシュの発現のマイクロアレイは、ロシュNimbleGen（マディソン、WI）によって印刷された。この技術デモは、cDNA産物、マイクロアレイプラットフォームへの標識cDNA産物のハイブリダイゼーション、およびつの色の分析の戦略を使用して信号集録をスキャンする配列の蛍光標識が含まれています。

プロトコル

パート1：cDNAの蛍光標識

マイクロアレイ実験で使用されているのCy3色素は、光分解に敏感です。手順は、光の最小の量で行われるべきである。ラベリングのプロトコールは、マニュアル¹ BioPrimeアレイCGHゲノムラベリングシステムから翻案されました。

1. ラベリング反応の試薬は-20℃で保存されていますBioPrimeアレイCGHゲノムラベリングシステムの雪解け2.5Xランダムプライマーバッファ、10X dCTPをミックス、およびヌクレアーゼフリー水から。また、Cy3でdCTPを染料を解凍。解凍後、一時的に使用する前に全ての試薬を軽く遠心する。
2. 別のラベリング反応には分析する各cDNAサンプルのために完了する必要があります。 0.6ミリリットル厚肉チューブに86μlの合計量を達成するために500ngのcDNAを、40μlの2.5倍のランダムプライマーのバッファとヌクレアーゼフリー水を加える。
3. よく混和後スピンダウンする。 100で5分間反応をインキュベートしますクラー上でCを。
4. 直ちに10分間氷浴のスラリーに反応して転送する。
5. 各チューブにして10μlの10X dCTPをミックス、2μlを1mMのCy3でdCTPおよび2μlのエキソKlenow DNAポリメラーゼを追加。エキソKlenow DNAポリメラーゼが必要になるまで冷凍庫ままにしておく必要がありますし、常に氷上で保存する。
6. よく反応を混和後スピンダウンする。
7. サーマルサイクラーで16時間、37℃で反応します。

パート2：標識cDNAの沈殿

1. NimbleGen社のハイブリダイゼーションシステム上のプロトコルの順番に続いて、システムが42℃に平衡化することができます前に、
2. 各反応について、1.5 mlチューブにマイクロコンの列を配置します。ラベリング反応（100μl）での内容に続いて、各カラムに300μlの0.1 × SSCを追加。
3. 4℃で10分間16100 × gで列を含むチューブを遠心℃に
4. 色でわずかにピンクであること、および列に別の300μlの0.1 × SSCを追加することが貫流して、捨ててください。
5. 4℃で10分間、16100 × gで遠心分離を繰り返す℃に
6. フロースルーを捨て、カラムに追加の300μlの0.1 × SSCを追加します。
7. 4℃で12分間16100 × gで遠心する℃、
8. フロースルーを捨てる。を通る流れは、この最後の洗浄後に明確にする必要がありますし、カラムにピンクの標識cDNAを見ることができるはずです。
9. カラムに100μlのヌクレアーゼフリー水を適用します。 1.5 mlチューブからカラムを取り外し、新しい1.5 mlチューブにカラムを反転させる。
10. 4℃で2分間2300 × gで遠心する℃、標識cDNAは、チューブの底に収集し、水で再水和されるべきである。
11. DNA濃度を計算し、Cy3の比率にヌクレオチドが23.15を乗じて_550分の260の比率に等しいどこ比を染めるために、ベースを計算することにより、染料取り込みを評価するために製造業者の指示に従って光度計ND - 1000分光光度計を使用してください。色素比ベースでは50と80の間でなければなりません。
12. cDNAを十分に標識した場合場合、アリコート6μgのは、新しい1.5 mlチューブに標識cDNA。
13. 3 M NaOAc、pHが5.2とイソプロパノール1Xボリュームの0.1Xボリュームでミックス。混合物を室温で30分間暗所でインキュベートすることができます。
14. 次に室温で20分間16100 × gでサンプルを遠心する。
15. カラーでピンクになるはずDNAペレットを、乱すことなく上澄みを注意深く捨てます。
16. 500μlの70％エタノールと静かに転倒混和を追加することにより、エタノールの洗浄を行います。
17. 室温で5分間、16100 × gでサンプルを遠心分離します。
18. チューブを反転、上清を除き、ペレットを5分間乾燥させます。希望やプロトコルがハイブリダイゼーションのステップを継続することができる場合は、このステップでペレットを-20℃で保存することができる。

パート3：ハイブリダイゼーション

ハイブリダイゼーションの手順は、遺伝子発現解析²のロシュNimbleGenアレイのユーザーガイドを改作したものです。

1. ヌクレアーゼフリー水を5μlでペレットを溶解する。
2. 一度ペレットは、表1に記載されているハイブリダイゼーションのコンポーネントを追加し溶解させる。ハイブリダイゼーションのコンポーネントは、ロシュNimbleGenハイブリダイゼーションキットからです。すべてのコンポーネントが追加された後、総容積は、現在18μlを合計してください。良く混和し、手短に下部の内容を収集するためにチューブをスピン。
3. 次のステップは、5分間95℃でヒートブロック上に置くことで標識されたcDNAを変性することです。
4. 配列は、以下の手順で準備している間すぐにNimbleGen社のハイブリダイゼーションシステムにチューブを移す。
5. マイクロアレイは、常に慎重に処理され、製造元の指示に従って保存してください。ロシュNimbleGenは、室温で乾燥した暗所で彼らの表現の配列を格納することをお勧めします。
6. NimbleGen社の配列処理のアクセサリーで提供される精密ミキサーアライメントツール（PMAT）に配列を読み込みます。
7. PMATにX1のミキサーをロードし、ピンセットが付いている粘着ストリップを削除する。しっかりとPMATを閉じます。 PMATの穴からミキサーへの圧力を適用し、ゆっくり配列とミキサーがPMATから外れるように開きます。
8. しっかりと配列へのシールが完全であることを確認すると、任意の気泡を除去するためにミキサーの外周りbrayerと圧力を適用する。温めるハイブリダイゼーションシステムにアレイミキサー複合体を置きます。
9. 変位のピペットを使用して、徐々に充填ポートに標識された試料の15μlを加える。これは、ミキサーの中央に位置する穴です。サンプルは、任意の気泡なしでミキサーを通して均等に広がるようにピペットにゆっくりと着実な圧力を適用する。ポート穴と粘着テープでシールのポートの穴から余分なサンプルを拭き取ります。
10. ラッチを閉じて、NimbleGen社のハイブリダイゼーションのシステムでプログラムBを使用してハイブリダイゼーション溶液の混合を開始。マイクロアレイは、16〜20時間ハイブリダイズすることができます。

パート4：ポストハイブリダイゼーションの洗浄及びマイクロアレイのスキャニング

洗浄およびスキャンの手順は、遺伝子発現解析²のロシュNimbleGenアレイのユーザーガイドを改作したものです。

1. 一度ハイブリダイゼーションは、表2に示す洗浄バッファを準備完了に近いです。 42〜プレ暖かい洗浄バッファーのIA℃の水浴でC。
2. GenePix 4000Bアレイスキャナーの電源を入れ、スキャナは使用前に約15分間ウォームアップすることができます。
3. 皿に予め温めておいた洗浄バッファーのIAを注ぐ。
4. 治具（NimbleGen社の配列処理のアクセサリーに付属）にNimbleGen社のハイブリダイゼーションシステムとスライドから、アレイミキサー複合体を取り外します。水没の予め温めておいた洗浄バッファーのIAにアセンブリと慎重にスライドから剥離でミキサーを取り外します。
5. Wash BufferをIAで15秒のための治具及び撹拌機からアレイを削除します。
6. すぐに室温の洗浄緩衝液のIBのスライドラックに配列を転送する。 2分間激しくスライドラックに撹拌。
7. 洗浄バッファーIIにスライドラックを移し、1分間振とうする。
8. 15秒間洗浄緩衝液IIIおよび撹拌にスライドラックを移す。
9. すべての水分を除去するために2分間スライド乾燥遠心し、スピンに配列を転送します。スキャンに進みます。
10. それは、染料が光とオゾンの両方に敏感なのですぐに配列をスキャンすることをお勧めします。
11. GenePix 4000Bアレイスキャナーに、配列、バーコードを読み込みます。
12. GenePix Proソフトウェアを開き、アレイのスキャンに進みます。ロシュNimbleGenの遺伝子発現アレイは、1つのカラーハイブリダイゼーションの戦略をたてて行う。その結果、唯一の波の長さは、スキャン用に要求される。 532nmのレーザーを使用してCy3の蛍光シグナルをスキャンします。ハードウェア設定]ダイアログボックスを開き、500の値に532nmのレーザーのPMT値を設定します。
13. ハードウェア設定]ダイアログボックスで、100％にパワーを設定し、画素サイズ5ミクロン、平均1〜の行、および0ミクロンに位置を合わせます。
14. プレビュースキャンを実行し、スキャン領域を設定します。
15. スキャン実行。
16. 一度のスキャンでは画像のヒストグラムを確認し完了している。理想的には1E - 5正規化数は機能の1〜2％が飽和している65000飽和限界の意味になっているはず。正規化されたカウントが1e - 5より小さい場合、PMTゲインと再スキャンスライドを増加させる。正規化されたカウントが1e - 5よりも大きい場合、PMTゲインと再スキャンスライドを減少させる。
17. 一度スキャン画像の保存が完了しています。それは、参照を容易にするための画像のための標準的な命名規則を選択することをお勧めします。画像は、現在データの正規化と強度の値の計算のための好みのデータ解析プログラムに読み込むことができます。

代表的な結果

は、まず、0.1 × SSCで洗浄を開始するcDNAのCy3蛍光標識反応の効率を評価するために始めることができます。後続の各洗浄中を通る流れは、明確な連鎖の中の最後の流れと色で小さいピンクになるはず。さらに、Cy3標識cDNA産物は、これらの洗浄ステップの間に列に表示されるはずです。フロースルーの色が明るいピンクであるか、または列にはピンクの製品がない場合、これは標識反応が正常に進行しなかったことを示しています。標識反応は定量的に色素の比率（図1）に標識DNAと塩基の濃度を決定するために光度計ND - 1000分光光度計を用いて評価することができる。ラベリング反応は日常的に我々の研究室でラベルされたDNAの少なくとも10μgを得られます。染料の取り込みをCy3比ヌクレオチドは、23.15を乗じて_550分の260の比率に等しいシンプルなベース/染料比を用いて計算することができます。 50から80に至るまでの値は、標識反応に十分な染料の取り込みを示している。ラベリング反応は、マイクにサンプルのハイブリダイゼーション、DNAまたは悪い染料の取り込みの低濃度を生成する場合、roarrayは推奨されていないとラベリング反応が繰り返される必要があります。

ハイブリダイゼーションの質の評価は、画像のヒストグラムとマイクロアレイのスキャンされた画像（図2）を評価することによって行うことができる。許容ハイブリダイゼーションは、500の近くに設定されたPMT値で飽和機能（すなわち、65,000飽和限界で1E - 5の正規化カウントが得られる）の1〜2％になります。 PMT値は65,000飽和限界で1E - 5正規化数を達成するために500から大幅に調整する必要がある場合、これは一般的にマイクロアレイの標識cDNAの貧しい人々のハイブリダイゼーションを示している。このデータはその後の分析を通して継続されている場合、データの品質が構成されます。ハイブリダイゼーションの品質も質的にスキャンされた配列（図3）の画像を表示することにより評価することができる。ロシュNimbleGenハイブリダイゼーションキットはCy3 -および配列のアライメント機能にハイブリダイズCy5標識48merオリゴヌクレオチドの位置合わせのオリゴの混合物が含まれています。アレイ上の他の機能へのアライメントオリゴの強度の定性的な評価では、配列に蛍光標識cDNAのハイブリダイゼーション効率の品質チェックを可能にします。さらなる分析に続いて、あなたの分析したデータの散布図は、遺伝子発現の相対レベルを決定するために、差動（図4）あなたのサンプル間で発現される遺伝子を同定するために使用することができます。

図1。 cDNAをCy3で標識した。標識cDNA収量および色素の取り込みから光度計のスペクトルは、光度計ND - 1000分光光度計を用いて評価することができる。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

図2。ハイブリダイゼーションのマイクロアレイスキャン。質のためのGenePixのヒストグラムは、画像のヒストグラムを評価することによって評価することができます。許容ハイブリダイゼーションは、500の近くに設定されたPMT値が65000飽和限界で1E - 5正規化されたカウントで飽和機能の1〜2％になります。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。

図3。スキャンしたマイクロアレイ画像。ブリダイゼーションの品質は、マイクロアレイのスキャンした画像を表示することによって評価することができます。画像は、ほこりや機能の蛍光強度の正確な計算を防止するため、各機能の可視化を禁止し、他の干渉要因の存在を検査すべきである。アライメントオリゴの強度は、ハイブリダイゼーション効率を評価するために、アレイ上の他の機能と比較することができます。

図4。分析されたマイクロアレイ実験の散布図。この手順の目的は、差動あなたのサンプル中で発現される遺伝子を同定することです。マイクロアレイデータをさらに分析し、示差的に発現される遺伝子を可視化するために散布図で表示することができます。

表1。ブリダイゼーションのステップ2で追加するには、ロシュNimbleGenハイブリダイゼーションキットからのコンポーネント。

コンポーネント	ボリューム
サンプル（水に溶解）	5μlの
2Xハイブリダイゼーションバッファー	9μL
ふたの	3.6μL
アライメントオリゴ	0.4μL
合計ボリューム	18μlの

表2：ハイブリダイゼーション後のアレイの洗浄のために準備するためにバッファを洗浄する。

コンポーネント	洗浄バッファーIA *	バッファIBを洗う	洗浄バッファーII	ウォッシュバッファーIII
水	225ミリリットル	225ミリリットル	225ミリリットル	225ミリリットル
10X Wash BufferをI、II、またはIII	25ミリリットル	25ミリリットル	25ミリリットル	25ミリリットル
1 M DTT	25μlの	25μlの	25μlの	25μlの
合計ボリューム	250ミリリットル	250ミリリットル	250ミリリットル	250ミリリットル

* 42〜プリ暖かい° C

ディスカッション

ここで詳述するものを含む多くのマイクロアレイのプロトコルは、、ハイブリダイゼーションを測定し、定量化の手段として蛍光染料を使用してください。 Cy3の蛍光色素は、写真とオゾン劣化に敏感である。それは手順が最小限の照明で行われることをお勧めします。さらに、小さなダスト粒子は、ハイブリダイゼーションとスキャニングの妨げになることがあります。特別な注意が作業領...

資料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Array Microcentrifuge Dryer		ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System		Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP		PerkinElmer	NEL576
GenePix 4000B		Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30		Millipore	42411
NimbleGen Array Processing Accessories		Roche NimbleGen	5223539001
NimbleGen Hybridization Kit		Roche NimbleGen	5223474001
NimbleGen Hybridization System 4		Roche NimbleGen	5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit		Roche NimbleGen	5223504001
X1 Mixers		Roche NimbleGen	5223725001