Глобальный анализ экспрессии генов Использование данио рерио Платформа Microarray олигонуклеотидов

Резюме

Гена микрочипы являются мощными инструментами в генной экспрессии на профилирование генома уровне. Эта технология применения в различных биологических дисциплин, включая биологию развития и токсикологии. В этом видео мы подробно протокол для глобального анализа экспрессии генов с помощью комплексного платформы микрочипов олигонуклеотида для рыбок данио.

Аннотация

Гена микрочипов технология позволяет количественное измерение и профилирования экспрессии генов стенограммы уровней генома основе. Гена микрочипов технология используется во многих биологических дисциплин в различных приложениях, включая глобальный анализ экспрессии генов в зависимости от стадии развития, на болезненное состояние, а в токсические свойства. При этом, мы включаем демонстрация глобального анализа экспрессии генов с помощью комплексного данио конкретных олигонуклеотидных микрочипов платформы. Микрочипов данио выражение платформа содержит 385000 зондов, 60 пар оснований в длину, допрос 37157 цели до 12 зондов в цель. Для этой платформе, все кДНК и геномной информации, доступной для рыбок данио была собрана из различных баз данных геномной в том числе Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), УСК ( http://genome.ucsc.edu), а ZFIN (http://www.zfin.org). В результате этого выражения массив обеспечивает полное покрытие текущих транскриптома рыбок данио. Микрочипов данио выражение было напечатано Рош NimbleGen (Мэдисон, Висконсин). Эта техническая демонстрация включает флуоресцентные маркировки кДНК продукт, гибридизации меченой кДНК продукта на платформу микрочипов, а также массив сканирования для получения сигнала использованием одного цвета анализ стратегии.

протокол

Часть 1: флуоресцентные маркировки кДНК

Cy3 краска, используемая в эксперименте микрочипов чувствителен к фото-деградации. Процедура должна проходить в минимальное количество света. Маркировки протокол был адаптирован с BioPrime массива CGH Геномная Маркировка Ручная ^1.

1. Реагентов для маркировки реакции хранятся при температуре -20 ° C. С BioPrime массива CGH Геномная система маркировки оттепели 2.5X Случайные Primer буфера, 10X смесь дЦТФ и нуклеазы без воды. Также оттепели Cy-3-дЦТФ красителя. После оттаивания, кратко центрифуги все реагенты перед использованием.
2. Отдельные реакции маркировке должны быть завершены для каждого образца кДНК для анализа. Into 0,6 мл толстостенные трубки добавить 500 нг кДНК, 40 мкл буфера 2.5X Случайные Primer и нуклеазы без воды для получения общего объема 86 мкл.
3. Хорошо перемешайте и кратко центрифуги. Инкубируйте реакции в течение 5 минут при 100 ° С на амплификаторе.
4. Сразу же реакции передачи в суспензии ледяной бане в течение 10 минут.
5. Для каждой трубки затем добавить 10 мкл 10X смесь дЦТФ, 2 мкл 1 мМ Cy-3-дЦТФ и 2 мкл Exo Кленова ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы Кленова Exo следует оставить в холодильнике пока не понадобится, и всегда должны быть на льду.
6. Смешайте реакции хорошо и кратко центрифуги.
7. Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 16 часов в амплификаторе.

Часть 2: Осаждение Маркированный кДНК

1. Перед тем как продолжить в протоколе включения системы гибридизации NimbleGen и позволяют системе, чтобы уравновесить до 42 ° C.
2. Для каждой реакции, место микроконтроллер колонку в 1,5 мл трубки. Добавить 300 мкл 0.1X SSC для каждого столбца, после которого содержание маркировки реакции (100 мкл).
3. Центрифуга трубки, содержащей столбец в 16 100 мкг в течение 10 минут при 4 ° C.
4. Откажитесь от потока через, который может быть слегка розового цвета, и добавить еще 300 мкл 0.1X SSC на колонну.
5. Повторите центрифугированием при 16 100 мкг в течение 10 минут при 4 ° C.
6. Откажитесь от потока через и добавить еще 300 мкл 0.1X SSC на колонну.
7. Центрифуга на 16 100 мкг в течение 12 минут при 4 ° C.
8. Отменить течь через. Поток через должно быть ясно, после этого последнего мыть, и вы должны быть в состоянии видеть розовые помечены кДНК на колонне.
9. Применить 100 мкл нуклеазы без воды к колонке. Удалите столбец из 1,5 мл трубки и инвертировать колонку в новой 1,5 мл трубки.
10. Центрифуга на 2300 мкг в течение 2 минут при 4 ° C. Помечены кДНК регидратации должно быть в воде, которая скапливается на дне пробирки.
11. Используйте NanoDrop ND-1000 спектрофотометр в соответствии с инструкциями изготовителя для расчета концентрации ДНК и оценить красителя включение путем расчета базы для окраски соотношение где нуклеотидной к Cy3 отношение равно ₂₆₀ / ₅₅₀ умноженная на коэффициент 23.15. База для окраски соотношение должно быть между 50 и 80.
12. Если кДНК, если помечены достаточно, аликвоту 6 мкг меченой кДНК в новый 1,5 мл трубки.
13. Смешайте в 0.1X объема 3 М NaOAc, рН 5,2 и 1X объем изопропанола. Разрешить смеси для инкубации в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре.
14. Следующая центрифуги образца при 16 100 мкг в течение 20 минут при комнатной температуре.
15. Тщательно отказаться супернатант, не нарушая ДНК гранулы, которые должны быть розового цвета.
16. Выполните этанола мыть путем добавления 500 мкл 70% этанола и перемешать, осторожно инверсии.
17. Центрифуга образца при 16 100 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре.
18. Удалить супернатант, инвертировать трубки, и позволяет гранул высохнуть в течение 5 минут. На данном этапе гранулы могут храниться при температуре -20 ° С, при желании или протокол может быть продолжена до гибридизации шаг.

Часть 3: Гибридизация

Гибридизации процедура адаптированный Руководство Roche NimbleGen Массивы пользователя для Гена ² Анализ выражений.

1. Растворить осадок в 5 мкл нуклеазы без воды.
2. Как только осадок растворенные добавить гибридизации компонентов, перечисленных в таблице 1. Гибридизация компоненты от гибридизации Kit Рош NimbleGen. В конце концов компоненты добавляются в общем объеме должна теперь всего 18 мкл. Хорошо перемешайте и кратко спина трубки для сбора содержимого на дне.
3. Следующий шаг заключается в денатурации помечены кДНК, разместив его на тепло блока при температуре 95 ° С в течение 5 минут.
4. Сразу передачи трубки системы гибридизации NimbleGen в то время как массивы, подготовленный в следующих шагах.
5. Microarrays всегда должны быть бережно хранятся в соответствии с инструкциями производителя. Рош NimbleGen рекомендует их хранения массивы выражение в темноте с осушителем при комнатной температуре.
6. Нагрузка массива в выравнивание Precision Смеситель Tool (PMAT), представленные в принадлежности NimbleGen обработки массивов.
7. Load X1 смесителя на PMAT и удалить клейкой полосой щипцами. Закрыть PMAT надежно. Подайте давление в смеситель через отверстие в PMAT и медленно открытым, так что массив и микшер абстрагироваться от PMAT.
8. Твердо давление с Брейер вокруг внешней смеситель для обеспечения уплотнения массива, является полной и, чтобы удалить пузырьки. Место массива смесителя комплекса на гибридизация системы тепло.
9. Использование смещение пипетки, медленно добавить 15 мкл образца в меченых заполнить порт. Это отверстие, расположенное в центре микшера. Применить медленно и постоянное давление на пипетку так, что образец равномерно распределяется через микшер без пузырьков воздуха. Вытрите лишнюю выборки из порта отверстия и печатью иллюминаторы с клейкими полосками.
10. Закрыть задвижку и начать перемешивания гибридизации решения с использованием программы B по системе гибридизации NimbleGen. Разрешить микрочипов для гибридизации в течение 16-20 часов.

Часть 4: Пост-гибридизации Моет и сканирование Microarray

Мытье и процедуры сканирования заимствован из руководства компании Рош NimbleGen Массивы пользователя для анализа экспрессии генов ^2.

1. После гибридизации близится к завершению подготовка мыть буферов, как указано в таблице 2. Предварительно теплой Промывочный буфер И. А. до 42 ° С на водяной бане.
2. Включите GenePix сканер массив 4000B и позволяет сканеру теплой в течение примерно 15 минут перед использованием.
3. Налейте подогретого Промывочный буфер И. А. в блюдо.
4. Удаление массива смесителя комплекса из системы NimbleGen Гибридизация и скользить в джиг (поставляется в принадлежности NimbleGen обработки массивов). Погрузите сборки в подогретого И. А. промывочного буфера и осторожно снимите смеситель пилинг от слайда.
5. Удалить из массива джиг и агитировать за 15 секунд в промывочный буфер IA.
6. Быстрый перенос массива в слайд стойке в комнатной температуре IB промывочного буфера. Перемешивают слайд стойку энергично в течение 2 минут.
7. Передача слайд стойку в промывочный буфер II и агитировать за 1 минуту.
8. Передача слайд стойку в промывочного буфера III и агитировать за 15 секунд.
9. Передача массива в слайд сушки центрифуги и спина в течение 2 минут, чтобы удалить всю влагу. Приступить к сканирования.
10. Рекомендуется для сканирования массива немедленно, так как краситель чувствительны к свету и озону.
11. Нагрузка массив, штрих-код вниз, в массиве сканер GenePix 4000B.
12. Открытое программное обеспечение GenePix Pro и перейдите к сканирование массива. Рош NimbleGen массивы экспрессии генов использовать один цвет гибридизации стратегии. В результате только одна длина волны, необходимые для сканирования. Сканирование Cy3 флуоресценции сигнала с использованием 532 нм лазер. Открытые аппаратные настройки диалогового окна и установить ФЭУ значение 532 нм лазер значение 500.
13. В аппаратной настройки диалогового окна, установить мощность до 100%, размер пикселя до 5 мкм, линии в среднем в 1, и положение фокуса до 0 микрон.
14. Выполните предварительный просмотр сканирования и установить область сканирования.
15. Выполните проверку.
16. После завершения сканирования проверить гистограмму изображения. В идеале 1e-5 рассчитывает нормированное должно быть 65000 предела насыщения означает, что ~ 1-2% возможностей насыщены. Если нормированная насчитывает меньше 1e-5, увеличения PMT усиления и повторное сканирование слайдов. Если нормированная насчитывает больше, чем 1e-5, снижение PMT усиления и повторное сканирование слайдов.
17. После завершения сканирования сохранить изображение. Рекомендуется выбирать стандартное соглашение об именовании для изображений, для удобства использования. Изображение теперь могут быть загружены в программу анализа данных предпочтения для нормализации данных и расчет интенсивности значения.

Представитель Результаты

Вы можете сначала начинают оценивать эффективность флуоресценции Cy3 реакции маркировки кДНК, когда начала промывок 0.1X SSC. В течение каждого последующего мытья потока через должно стать меньше розового цвета с последним потока через ясно. Кроме того, Cy3 меченные кДНК продукт должен быть виден на колонку в эти промывания. Если течь через ярко-розовый цвет или нет розовых продукт на колонке, это хороший признак, что маркировка реакции не идти правильно. Маркировки реакции можно оценить количественно использованием NanoDrop ND-1000 спектрофотометр для определения концентрации меченого ДНК и базу для окраски отношение (рис. 1). Маркировки реакции обычно дает не менее 10 мкг меченого ДНК в нашей лаборатории. Dye включения могут быть рассчитаны с помощью простого базового / красителя соотношение где нуклеотидной к Cy3 отношение равно ₂₆₀ / ₅₅₀ умноженная на коэффициент 23.15. Значения в диапазоне от 50-80 указывают на достаточное красителя включения в маркировке реакции. Если маркировка реакции дает низкую концентрацию ДНК или плохое включение красителя, гибридизации образца на микрофонroarray не рекомендуется и маркировки реакция должна быть повторена.

Оценка качества гибридизация может осуществляться путем оценки гистограммы изображения и отсканированное изображение микрочипов (рис. 2). Приемлемые гибридизации будет иметь 1-2% насыщенных функциями (то есть, уступая 1e-5 нормированы рассчитывает на 65000 предела насыщения) с ФЭУ значение, установленное около 500. Если PMT стоимость должна быть скорректирована резко от 500 до достижения 1e-5 нормированы рассчитывает на 65000 предела насыщения, это обычно указывает на плохую гибридизации меченой кДНК микрочипов. Качество данных будет состоять, если эти данные продолжалось в течение последующего анализа. Гибридизация качества также могут быть качественно оценены просмотре изображений отсканированных массива (рис. 3). Гибридизация Рош NimbleGen Набор содержит смесь выравнивание олиго из Cy-3-и Cy5 меченных олигонуклеотидов 48mer что скрещиваться с выравниванием функции на массивах. Качественная оценка интенсивности выравнивание олигонуклеотидов к другим функциям в массиве позволяет проверки качества на эффективность гибридизации флуоресцентно-меченные кДНК на массив. После дальнейшего анализа, точечный график вашей проанализировали данные могут быть использованы для определения относительного уровня экспрессии генов и, чтобы идентифицировать гены, которые разному экспрессируются между образцов (рис. 4).

Рисунок 1. NanoDrop спектр от кДНК помечены Cy3. Маркированный кДНК урожайность и краситель включения можно оценить, используя NanoDrop ND-1000 спектрофотометр. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

Рисунок 2. Гистограмма GenePix для микрочипов сканирования. Качество гибридизации можно оценить с помощью оценки гистограмму изображения. Приемлемые гибридизации будет иметь 1-2% возможностей насыщенный 1e-5 нормированы рассчитывает на 65000 предела насыщения с ФЭУ значение, установленное около 500. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.

Рисунок 3. Отсканированное изображение микрочипов. Гибридизация качество можно оценить, просмотрев отсканированное изображение микрочипов. Изображение должно быть проверены на предмет наличия пыли и других мешающих факторов запрещающие визуализации каждой функции и, таким образом, предотвращая точного расчета интенсивности флуоресценции функцию. Интенсивность выравнивание олигонуклеотидов можно сравнить с другими функциями в массиве для оценки эффективности гибридизации.

Рисунок 4. Разброс участок проанализированы микрочипов эксперимента. Целью этой процедуры является выявление генов, которые разному экспрессируются в образцах. Microarray данные могут быть дополнительно проанализированы и просмотреть в точечной диаграммы для визуализации генов, дифференциально выражены.

Таблица 1. Компоненты из Рош Kit Гибридизация NimbleGen добавить для гибридизации шагу 2.

Компонент	Объем
Пример (растворенный в воде)	5 мкл
2X буфером гибридизации	9 мкл
Hyb	3,6 мкл
Выравнивание Oligo	0,4 мкл
Общий объем	18 мкл

Таблица 2. Вымойте буфера, который будет подготовлен для мытья массивов следующих гибридизации.

Компонент	Промывочный буфер И.А. *	Промывочный буфер IB	Промывочный буфер II	Промывочный буфер III
Воды	225 мл	225 мл	225 мл	225 мл
10X Промывочный буфер I, II, III или	25 мл	25 мл	25 мл	25 мл
1 М ДТТ	25 мкл	25 мкл	25 мкл	25 мкл
Общий объем	250 мл	250 мл	250 мл	250 мл

* Pre-теплой до 42 ° C

Обсуждение

Многие протоколы микрочипов, в том числе один подробную здесь, использовать флуоресцентные красители, как средства измерения и количественной гибридизации. Cy3 флуоресцентного красителя чувствителен к фото и озона деградации. Рекомендуется, чтобы процедура проводится в минимальном о?...

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Array Microcentrifuge Dryer		ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System		Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP		PerkinElmer	NEL576
GenePix 4000B		Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30		Millipore	42411
NimbleGen Array Processing Accessories		Roche NimbleGen	5223539001
NimbleGen Hybridization Kit		Roche NimbleGen	5223474001
NimbleGen Hybridization System 4		Roche NimbleGen	5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit		Roche NimbleGen	5223504001
X1 Mixers		Roche NimbleGen	5223725001