のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

要約

このビデオ、記事では、単一または複数単離するための方法を提示ショウジョウバエ DAニューロン。分離された神経細胞から得られたRNAは、容易に定量RT - PCRやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用することができます。

要約

ショウジョウバエ末梢神経系（PNS）の樹状分枝（DA）ニューロンはクラス特有の樹状突起の形態形成の^1,2の分子メカニズムを調査するための優れたモデルシステムを提供しています。クラス固有のDAニューロンの発達の分子解析を容易にするために、それは純粋な集団で、これらの細胞を得ることが不可欠です。異なる細胞、および組織特異的なRNAの分離技術の範囲は、磁気ビーズをベースセル精製^3,4、蛍光活性化細胞選別^{（FACS）5-8、}およびRNA結合タンパク質に基づいて戦略を^9日のなしを含むショウジョウバエの細胞にもありますが、これらのメソッドは、容易に空間的な精度の高い単一または複数のクラス固有のショウジョウバエ DAニューロンを単離するために利用することができます。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、空間分解能と高精度に組織切片から特定の細胞型を分離するために使用できる非常に強力なツールとして登場しました。単離された細胞から得られたRNAは、その後、定量RT - PCRおよび特定の細胞型^10月16日内マイクロアレイの発現プロファイリングを含む、解析に使用することができます。日付に、LCMは広く開発の三齢幼虫期におけるDAニューロンを含むショウジョウバエの組織や細胞^17,18、の分析に適用されていない。

ここでは、LCMの赤外線（IR）クラスを使用してショウジョウバエの DAニューロンの単離のために私達の最適化されたプロトコルを提示する。このメソッドは、高い特異性と空間分解能を持つ単一の、クラス固有のまたは複数のDAニューロンのキャプチャが可能になります。年齢をマッチさせたUAS - mCD8を表現する三齢幼虫：：クラスIV DAニューロンの特定のPPK - GAL4 ²⁰ドライバーまたはパン- DAニューロン固有のどちらの制御下にGFP ¹⁹遺伝子21 - 7 - GAL4 ²¹ドライバは、これらのために使用された実験。孤立したDAニューロンから得られたRNAは非常に高品質のものであり、直接定量RT - PCRやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。さらに、このLCMプロトコルが容易にGFPの細胞型特異的、GAL4 -ドリブン発現パターンに応じて、さまざまな開発段階に依存する他のショウジョウバエの細胞タイプをキャプチャするために適応させることができます。

プロトコル

ショウジョウバエ末梢神経細胞のLCMに関する一般のコメント

アップ組織のタイプと必要なセル数に応じて、LCMのための週以上に、6時間から許可する。

すべての手順は、標準的な手順は、次の厳密にRNaseフリーの条件下で実施されています。 21から7 - GAL4のいずれかを発現する幼虫、UAS - mCD8：：GFPまたはPPK - GAL4、UAS - mCD8：：GFPトランスジェニックレポーターラインはこれらの実験に使用した。

1。幼虫の準備

1. 30から40まで年齢をマッチさせた三齢幼虫を収集してのddH ₂ Oでそれらを洗うには、RNアーゼアウェイ（Sigma - Aldrich社）で簡単なすすぎ、そしてアウェイRNaseを除去するのddH ₂ Oで最終的な洗浄が続く。 OCTの幼虫を埋め込 ​​む前にきれいなキムワイプで完全に過剰のddH ₂ Oをオフウィック。
2. だけで十分な幼虫の単層をカバーするために、OCTの薄い（1.5 - 2mm）の層でクリーンな組織の埋め込み型と層にしてください。
3. 前の幼虫を埋め込むために、必要に応じて、° C組織の埋め込み型の0にOCTを冷却する。氷のブロックにOCTを含む鋳型を置くことによってこれを行います。これは、埋め込み処理中に、幼虫の動きを減らすのに役立ちます。
4. あらかじめ冷却OCTに対してクリーン幼虫を置き、互いに平行に配置します。幼虫が配置されると、徐々に幼虫の配置を乱すことなく、OCTで金型を埋める。ドライアイスブロック上に置くことで金型を凍結スナップ。 [ 重要なステップ ：。スナップ凍結の動きを減らすために即座に幼虫]このメソッドは、幼虫は、キャプチャするためのセクションごとに使用可能なセルの数を最大化する、単一の平面になるようになります。

それは、目的の細胞を識別するための組織形態を維持する必要がある場合、またはセクションごとに細胞数の期待値は、ステップ11に直接進むに満足であることが判明した場合。

細胞が特にラベル付けされており、このようなGFPやRFPなど、容易に識別できるマーカーを識別することができますが、セクションごとのセル数が低いことが判明した場合あるいは、その後50から10のステップは、使用可能なセルの数を増やすために役立つ可能性がありますセクションごとにキャプチャする。これらはオプションのステップであり、他の方法は良好な結果を提供するために失敗したときにセクションごとのLCMで使用可能なDAニューロンの数を増加させるための方法として、必要な場合にのみ考慮されるべきである。 [ 注意 ：このメソッドは、全体的な組織形態を混乱させると非常に困難な特定の空間的位置に基づいて、組織の同定を行うことがあります。]

5. としてステップ1で説明されている50〜70三齢幼虫を洗ってください。 RNaseフリーの1X PBSを500μlを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の幼虫を置きます。
6. 6月7日遅い強力なストロークで、ポリプロピレン乳棒（米国サイエンティフィック）を使用して幼虫をダウンス。
7. 幼虫のキューティクルが遠心チューブ]の底に落ち着くまで、上清を捨てる。ペレットは、主にDAニューロンを含むどのPNS、に幼虫のキューティクルから構成されていなければ5〜10秒（16,000（x）はgで解決策を遠心、しっかりと接着されている。
8. 1X PBSに懸濁する500μlの1X PBSでペレットのキューティクルペレットを2〜3回洗浄する。コンパクトなペレットを形成するために1分間に16,000（x）をgで解決策を回転させる。完全に細かいパスツールピペットを用いて上清を吸引除去する。
9. 慎重に清潔な薬を使用してマイクロチューブからペレットを削除し、そしてきれいなキムワイプの組織を使って余分なPBSをオフに放出する。 [ 注 ：これは、細胞の収率を高めるために可能な限りコンパクトにペレットを保つことが重要です]。 OCTの薄層（1mmの約）を含むプラスチック金型のコンパクトなキューティクルペレットを置きます。
10. 優しく薄い円形のエリアでペレット広がる。 OCTで金型をご記入のうえ、手順4で説明したように組織を凍結する。
11. クライオスタットを使用して、プレーン、ラベル付け、荷電、RNaseフリーのガラスの顕微鏡スライド5-8μmの厚さで凍結切片を切る。 [ 重要なステップ ：スライドの中央に近い位置の組織切片を。]
12. 直接ドライアイス上または-80℃でマイクロダイセクションの準備ができるまでスライドボックスクリーンのいずれかのスライドを保存する。組織の切削後の週にあるのが好ましいLCMを実行します。

PAUSEのPOINT

2。脱水および冷凍幼虫セクションからキューティクル除去

[ 重要なステップ ：脱水のためのすべてのソリューションが各LCMセッションの前に新鮮な準備をしなければならない。冷凍幼虫の組織切片の完全な脱水は、最適なマイクロダイセクションの効率を達成する上で不可欠です。]

1. -80℃の冷凍庫から冷凍幼虫の組織切片を含むスライドを削除し、ドライアイスの上に置きます。
2. ドライアイスから単一のスライドを削除すると、すぐにそれを直接置く70％エタノール固定液で満たされた50 mlコニカルチューブに、表1に示された推奨度に応じてRNaseフリーのddH ₂ Oですすぎ短いが続く。
3. 凍結切片の幼虫のクチクラの存在は、非特異的取り込みにつながる可能性のある効率的なLCMキャップ - 細胞接触を防止することにより、捕捉効率が損なわれる可能性があります。必要に応じて、組織切片からキューティクルをクリアするには、次の手順（4-5）を実施。
4. 静かに組織切片上に直接2.5％トリプシン50μlをピペットで、室温で5〜30秒インキュベートする。 [ 重要なステップ ：この手順では、最適化が必要な場合があります。インキュベーション時間は、マイクロダイセクションする組織やセクションの厚さに依存します。短いインキュベーションのキューティクルを削除するには不十分かもしれないのに対し、より長いインキュベーションは、目的の細胞を含むすべてをクリアされることがあります。]
5. トリプシンを除去し、緩く付着した表皮の断片にRNaseフリーのddH ₂ Oを含む50 mlコニカルチューブに簡単にセクションをすすいでください。
6. 脱水処理を完了するための推奨時間の残りのエタノール及びキシレン溶液（表1）のそれぞれに順番にスライドを浸し。
7. 脱水勾配に続いて、スライドが簡単に実行する前LCMに室温で60〜120秒間、穏やかな空気気流下で乾燥されています。 [ 注意 ：実行する前LCMに組織切片から完全にキシレンを乾燥させます。キシレンは、顕微解剖の障害の原因となるLCMキャップポリマー]を溶解することが知られている。

70％エタノール（固定液）	30から10秒
のddH 2 O	5〜10秒
2.5％トリプシンインキュベーション	5〜30秒
のddH 2 O	5〜10秒
70％エタノール	60秒
95％エタノール	60秒
100％エタノール	120秒
100％エタノール	120秒
100％キシレン	120秒
100％キシレン	120秒
穏やかな空気の流れで空気乾燥	60から120秒

表1：冷凍幼虫の組織切片のLCM脱水のための推奨手順。

3。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション

EGFPに最適化された弗素300落射蛍光光学系を搭載したPixCell IIE LCMの楽器は、LCMを行うために使用された。

[ 重要なステップ ：可能であれば、増加湿度による顕微解剖の効率の低下を防ぐために湿度制御室にマイクロダイセクションを実行します。部屋の湿度は、マイクロダイセクションの効率に影響を与える重要な要素です。低い部屋の湿度が高い部屋の湿度が低いマイクロダイセクションの効率につながることができますが増大静的-しがみつく、非特異的な取り込みで生じる可能性があります。我々25-50％の相対湿度条件との間で最適なLCMの効率を達成しました。]

1. 顕微鏡とレーザーのコントロールボックスの電源を入れてください。
2. HS LCMキャップ（Molecular Devices社）とポイカプセルのキャップホルダアセンブリをロードします。LCMキャップの2つのカートリッジを一度にロードすることができる。
3. モレキュラーデバイスソフトウェアを開き、スライド番号とキャップのロット番号を含む、実験の詳細を入力します。
4. キャプチャ領域に関連してキャップの適切なポジショニングを確保するためにジョイスティックを基準にして正しくPixCell IIE LCMの楽器との位置を上にカートリッジから新しいHS LCMキャップをロードする。
5. 顕微解剖用顕微鏡のステージ上で新鮮な乾燥幼虫の組織切片を含む顕微鏡スライドを置きます。
6. 接眼レンズまたはコンピュータの画面を使用して蛍光標識した細胞を見つけます。 ：PPK - GAL4、UAS - mCD8の高い特異性に起因する：GFPトランスジェニックレポーターのライン、クラスIV DAニューロンは、簡単にGFP蛍光で識別できます。
7. 件名[、計器の設定レーザーを中心とし、LCMは文献²²を参照してください実行するための手順の詳細なセットのために]をポイカプセルHS LCMキャップを使用してLCMする組織。
8. サイズが選択されたレーザーのスポットサイズに対応する正確な溶融ポリマーのスポットを、達成するために"電源"と"期間"レーザーパルスのパラメータを調整する。溶融ポリマー領域のサイズをカスタマイズする設定を調整します。スポット径7.5μmの、レーザー強度30から50 mWの、レーザーの時間と2-4ミリ秒と1〜2秒：次のパラメータは、単一のクラスIV DAニューロンをmicrodissectingのために使用されたセル当たりの恋心を使用した。 [ 重要なステップ ：適切な場所に必要なレーザーのパラメータは、組織の厚さと部屋の湿度条件と異なる場合があります。単一または複数のセルをmicrodissectingに必要な溶融ポリマーのスポットサイズを達成するための"電源"と"期間"の設定を調整します。]
9. 特異性を最大化するために、最小限の重複と強い蛍光を持つ細胞を顕微解剖。それぞれのキャップには、多数の細胞体を捕捉することが可能です。 [ 重要なステップ ：RNA分解を回避するためには、45分未満に脱水し、顕微解剖を含む総分析時間を制限する]
10. 一度に関心のあるすべての細胞が取り込まれている、マイクロダイセクションのセルでHS LCMキャップを持ち上げて、キャプチャされた細胞の存在を確認し、視覚的に不必要な細胞または破片の存在のためのキャップを検査するためにきれいなスライド上に置いた。

4。 LCM由来細胞からのRNA分離

1. ExtracSure（モレキュラーデバイス）デバイスへのマイクロダイセクションのセルを含むキャップを取り付けます。細胞を含むキャップの表面にRNA抽出バッファー（PicoPure、Molecular Devices社）の12μlを追加し、ExtracSureのデバイスへの反転薄肉反応チューブ（ジーンアンプ、Applied Biosystems）を接続します。アライメントトレイ（Molecular Devices社）上にアセンブリを配置し、インキュベーションのブロック（Molecular Devices社）℃のインキュベーター内の42〜予熱さでそれをカバーしています。
2. 30分のインキュベーションの後、2分間800（x）はgで抽出物を含むチューブを遠心する。チューブの蓋を閉め、-80細胞抽出物を保管° CのRNA精製のための準備が整うまで。

PAUSEのPOINT

3. 抽出し、カラムはPicoPure（Molecular Devices社）のRNA抽出キットの指示にしたがってRNAを精製する。 DNase処理は省略可能であり、必要に応じてRNA精製中に列を実行することができます。必要な、複数のLCMサンプルは、最終的なRNAの収量を高めるために、単一のカラムで精製時に一緒にプールすることができ、溶出緩衝液の少量（11〜30μL）（PicoPure、Molecular Devices社）で溶出し、-80℃で保存することができる場合使用直前まで、° C。必要に応じて1μlのアリコートをバイオアナライザ2100（Agilent Technologies社）にトータルRNAの品質を評価するために使用されることがあります。

代表的な結果

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、三齢幼虫（図1）から単一の、クラス固有のまたは複数のショウジョウバエ DAニューロンを単離するために使用されました。 LCMは、 ショウジョウバエ DAニューロンの細胞体の分離（図2a - c）の精度と高度の特異性を可能にする。また、これらの孤立したDAニューロンから精製したトータルRNAは、Agilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies社）（図で解析するときにシャープ5.8S、18Sおよび28SリボソームRNAのピークの存在によって示されるように、優れた品質であることがわかった2D）。

私たちの単離された細胞の神経細胞特異的な濃縮を評価するために我々は、神経遺伝子特異的マーカー、elavを使用して、リアルタイム定量的逆転写PCR（定量RT - PCR）を行った。定量RT - PCR解析のために、我々は内在性コントロール（rp49）のそれとΔΔCT法^23を用いて全体の幼虫から単離した全RNAの相対的にDAニューロンと正規化されたこの表現をマイクロダイセクションLCMでelav発現の相対レベルを計算する。これらの分析は、LCMでelavの相対的なレベルの2.5倍濃縮に明らかにミクロ解剖動物全体（図3）と比較して、DAニューロンのサンプルを。

図1： ショウジョウバエ末梢神経細胞のLCM。 （）三齢幼虫に一致した年齢が上に均一に配置された、選択洗浄および（b）OCTでcryomoldに埋め込 ​​まれ、-80℃で凍結C、（C）8μmシリアル組織切片は、標準的なクライオスタットを使用して作成され、（D）されていますスライドガラスを清掃してください。貼付された組織切片とスライドガラスが° Cの前LCM処理するために-80℃で保存されている。（E、F）すぐLCMの前に、組織切片は、簡単なのddH _{2 O}ですすぎ、続い70％エタノールで解凍し、一時的に固定されています（G）のスライドを簡単にトリプシンでインキュベートし、幼虫のセクションからキューティクル（黒）を除去するのddH ₂ Oで洗浄している。（H、I）の組織切片幼虫のクチクラのないし、エタノールの勾配でさらに脱水し、最後にキシレンでクリア熱不安定性ポリマーと。（j）に LCMキャップは、組織切片上に配置され、レーザーは、選択された蛍光細胞体にパルス化されます。レーザーパルスは、ポリマーを溶融し、選択したセル本体を覆う。キャプチャした細胞体とともにポリマーのキャップは、解除、および（K）され RNAの抽出緩衝液をセルに追加されます。 RNAの抽出緩衝液と一緒にキャプチャされた細胞は、30分間42℃でインキュベートされ、どちらか-80℃で保存、または直接RNA精製用に処理することができます。

図2：LCMは、DAニューロンの高精度のキャプチャを容易にする。 ：GFPレポーター株：（a）の脱水とトリプシンの代表画像は、PPK - GAL4によるGFPで標識された2つのクラスIV DAニューロン、UASmCD8を示 ​​し、実行する前LCM〜8ミクロンの組織切片を処理した。 （注）、ニューロンの一つは、キャプチャのために（矢じり）が強調表示されます。（b）のハイライト表示ニューロン（矢印）の細胞体が正常組織切片から高い特異性でマイクロ解剖である。一つのクラスの（C）エンドのビュー- IV DAニューロンは、LCMキャップでキャプチャ。シャープ5.8S、18Sの存在によって示されるように優秀なRNAの品質を示すLCM由来のDAニューロンから単離した全RNA、の（d）は Agilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies社）電気泳動図、および28S rRNAのピーク。

図3：定量RT - PCRは、全体の動物からの相対DAニューロンをキャプチャしたLCMにおける神経マーカーの遺伝子発現のかなりの濃縮を明らかにする DAニューロン（21 - 7 - GAL4を、キャプチャされたLCMにおけるニューロン特異的マーカー遺伝子の発現（elav）の定量RT - PCR分析を。 UAS - mCD8：：GFP）と動物全体が時代にマッチした三齢幼虫は三連で行った。 LCMキャプチャされたDAニューロンのelav発現の相対レベルは、内在性コントロール（rp49）とΔΔCT法^23を用いて全体の幼虫に対して相対的に正規化された。 LCMキャプチャされたDAニューロンのサンプルでelavの相対的なレベルの2.5倍濃縮は、動物全体からの相対観察された。

トラブルシューティング

問題：低品質の低下、またはRNA。

実験を通してRNaseフリーの状態を確認してください。 30分のスライドごとにLCMに費やす時間の量を減らしてみてください。 LCMを行う場合を除いてドライアイス上にスライドし、サンプルをしてください。それらがカットされると、組織切片を融解は避けてください。

問題：ほとんどの細胞はトリプシン処理（ステップ17〜18）中に、スライドから失われている。

トリプシン処理の時間を減らしてみてください。トリプシン濃度を下げてみてください。

問題：キューティクルとキャップポリマー上の他の非特異的組織破片の存在。

粘着メモ²²の粘着面にポリマーの表面をブロッティングにより組織の残骸を削除してください。

問題：低LCMの効率。

100％エタノール及びキシレンのインキュベーション時間を増やしてみてください。除湿機を使用して、部屋の湿度を下げる。

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ディスカッション

本明細書において提示されるプロトコルは、LCMを経由してショウジョウバエ末梢神経細胞の単離のための私達の最適化方法を説明します。このLCMプロトコルが開発の三齢幼虫の段階から、単一の、クラス固有のまたは複数のショウジョウバエ DAニューロンの特定の単離のために設計されたものですが、プロトコルのマイナーな修正は、容易に全ての発生から他のショウジョウ...

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