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요약

이 동영상 기사에서 우리는 격리하는 방법을 제시 하나 또는 여러 개의 Drosophila DA의 뉴런. 분리된 뉴런에서 얻은 RNA는 쉽게 qRT - PCR 또는 microarray 분석을 포함하여 다운 스트림 애플 리케이션에 사용할 수 있습니다.

초록

Drosophila 주변 신경계 (PNS)의 돌기 arborization (DA) 뉴런 수업 관련 dendrite의 morphogenesis 1,2를 기본 분자 메커니즘을 조사에 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다. 클래스 특정 DA 신경 발달의 분자 분석을 촉진하기 위하여, 그것은 순수한 인구에서 이러한 세포를 얻기 위해 매우 중요합니다. 다른 세포와 조직을 특정 RNA 격리 기술의 범위는 자석 구슬을 기반으로 세포 정화 3,4, 형광 활성 세포 정렬 (외과) 5-8, 그리고 전략 9 기반의 RNA 결합 단백질을 포함 Drosophila 세포, 존재하지만 아무것도 없어요 이러한 방법은 쉽게 공간 정밀도의 높은 학위를 하나 또는 여러 개의 클래스 특정 Drosophila 검찰의 뉴런을 분리 활용하실 수 있습니다. 레이저 캡처 Microdissection (LCM)은 공간 해상도와 정밀도의 높은 수준의 조직 섹션에서 특정 세포 유형을 분리하는 데 사용할 수있는 매우 강력한 도구로 떠오르고있다. 고립된 세포에서 얻은 RNA는 다음 qRT - PCR 및 특정 세포 유형 10-16 내의 microarray 표현 프로 파일링 포함하여 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 지금까지, LCM은 널리 개발의 세 번째 instar의 애벌레 단계에서 검찰의 뉴런을 포함 Drosophila 조직 및 세포 17,18의 분석에 적용되지 않았습니다.

여기 LCM의 적외선 (IR) 클래스를 사용 Drosophila 검찰의 뉴런의 격리를위한 최적화된 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 높은 특이성과 공간 해상도를 가진 단일 클래스의 특정 또는 여러 DA 뉴런의 캡쳐하실 수 있습니다. UAS - mCD8을 표현하는 연령 일치 셋째 instar의 유충 :의 통제하에 GFP 19 transgene 중 하나는 클래스 IV 다 신경 세포 특정은 PPK - GAL4 20 드라이버 또는 팬 - DA 뉴런 특정 21-7 - GAL4 21 드라이버는이 사용되었습니다 실험. 절연 검사의 뉴런에서 얻은 RNA는 매우 높은 품질이며 직접 qRT - PCR 또는 microarray 분석을 포함하여 하류 응용 프로그램을 위해 사용될 수 있습니다. 또한,이 LCM 프로토콜은 쉽게 다른 Drosophila 세포 유형에게 세포 유형 GFP의 특정, GAL4 기반의 표현 패턴에 의존 개발의 다양한 단계를 캡처하는 적용할 수 있습니다.

프로토콜

Drosophila 주변 뉴런의 LCM에 대한 일반적인 의견

최대 조직 유형과 필요한 세포의 숫자에 따라 LCM을 위해 일주일 이상을 6 시간에서 수 있습니다.

모든 절차는 표준 절차에 따라 엄격하게 RNAse없는 조건에서 수행하고 있습니다. 21-7 - GAL4 중 하나를 표현 애벌레, UAS - mCD8 : GFP 또는 PPK - GAL4, UAS - mCD8 : GFP 유전자 변형 기자 라인 이러한 실험에 사용되었다.

1. 애벌레 준비

  1. 30-40 연령 일치 셋째 instar의 애벌레를 수집하고 ddH 2 O에서 그들을 세차 RNAse 어웨이 (시그마 - 알드리치)에 간단한 rinses, 멀리 RNAse를 제거하는 ddH 2 O의 최종 세척 다음. OCT에서 애벌레를 삽입하기 전에 깨끗한 Kimwipe와 완전히 초과 ddH 2 O를 윅.
  2. 충분히 애벌레의 단일 계층을 커버하기 위해, 10의 얇은 (1.5 - 2mm) 레이어와 깨끗한 조직 포함 금형 및 레이어를 가져가라.
  3. 전에 애벌레를 포함하기 위해 필요한 경우, ° C 조직 포함 금형에서 0으로 OCT를 냉각. 얼음 블록에 OCT를 포함하는 주형을 배치하여이 작업을 수행합니다. 이것은 포함하는 동안 애벌레 움직임을 줄이는 데 도움이 될 것입니다.
  4. 미리 냉각 OCT에서 깨끗한 애벌레를 놓고 서로 병렬로 그들을 주선해드립니다. 애벌레가 정리되고 나면 천천히 애벌레 배열을 방해하지 않고 OCT와 금형을 입력합니다. 드라이 아이스 블록에 배치하여 금형을 고정 스냅. [중요 단계 :. 스냅인 동결 움직임을 줄이기 위해 즉시 애벌레]이 방법은 애벌레가 캡처 섹션마다 사용 가능한 세포의 수를 최대화 한 비행기에하실 수 있습니다.

그것은 관심의 세포를 확인하는 조직 형태를 유지하기 위해, 또는 섹션마다 세포의 예상 번호가 다음 11 단계로 바로 진행 만족 것으로 판명될 경우 필요한 경우.

세포가 구체적으로 분류하고 그러한 GFP 또는 RFP와 같은 쉽게 식별 표시와 함께 확인할 수 있지만, 섹션마다 세포의 숫자가 낮은 것으로 판명될 경우 또는 다음 5-10 단계 것은 가능한 세포의 수를 증가를 위해 도움이 될 수 있습니다 섹션마다 캡처하십시오. 이들은 선택 단계이며, 다른 방법은 유리한 결과를 제공하는 데 실패하면 섹션당 LCM 사용할 검찰의 뉴런의 수를 증가하는 방법으로, 필요한 경우에만 고려되어야합니다. [주의 :이 방법은 전체 조직 형태를 중단하고 매우 어려운 특정 공간 위치에 따라 조직 식별을 할 수 있습니다.]

  1. 로 1 단계에서 설명한 50-70 셋째 instar의 애벌레 씻으십시오. RNAse 무료 1X PBS 500 μl를 포함하는 1.5 ML의 microfuge 관에서 애벌레를 놓습니다.
  2. 6-7 느린 강력한 스트로크와 폴리 프로필렌 유봉 (미국 과학)를 사용하여 애벌레를 다운스.
  3. 16,000에서 솔루션을 원심 분리기 (X) 50-10초에 대한 G (애벌레 손톱이 microfuge 튜브 하단으로 정착까지]. 뜨는 폐기하십시오. 펠렛은 주로 애벌레 표피로 구성해야하는 검찰의 뉴런을 포함하여 PNS, , 단단히 준수합니다.
  4. 500 μl 1X PBS의 1X PBS와 resuspend 펠렛의 표피 펠렛 2-3 번 씻으십시오. 소형 펠렛을 형성하기 위해 1 분 16,000 (X) g에서 솔루션을 스핀. 완전히 벌금 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 대기음.
  5. 조심스럽게 청소 주걱을 사용하여 microfuge 관에서 펠렛을 제거하고 깨끗한 Kimwipe 조직을 사용하여 여분의 PBS를 심지. [주 : 이것은 세포 수율을 높이기 위해 가능한 소형으로 펠렛을 유지하는 것이 중요합니다]. OCT의 얇은 층 (약 1mm)이있는 플라스틱 금형에서 압축 표피 펠렛를 놓습니다.
  6. 부드럽게 얇은 원형 영역에 펠릿 밖으로 퍼졌다. OCT와 금형을 입력하고 4 단계에서 설명한대로 조직을 동결.
  7. 그라 이오 스탯을 사용하여, 일반, 라벨, 충전되지 않은, RNAse 무료 유리 현미경 슬라이드에 5-8 μm의 두께로 냉동 부분을 절단. [중요 단계 : 슬라이드의 중앙 근처에 위치 조직 섹션을.]
  8. 직접 드라이 아이스 또는 -80 ° C에서 microdissection 준비까지 슬라이드 박스 깨끗한 중 슬라이드를 저장합니다. 조직을 sectioning 후 일주일 이내 선호 LCM 수행합니다.

PAUSE 포인트

2. 냉동 애벌레 섹션에서 탈수 및 표피 제거

[중요 단계 : 탈수에 대한 모든 솔루션을 각 LCM 세션 전에 신선 준비되어야합니다. 냉동 애벌레 조직 섹션의 완전한 탈수는 최적의 microdissection의 효율성을 달성하기 위해 필수적입니다]

  1. -80 ° C의 냉동고에서 냉동 애벌레 조직 섹션을 포함하는 슬라이드를 제거하고 드라이 아이스에 그들을 놓으십시오.
  2. 드라이 아이스에서 하나의 슬라이드를 제거하고 즉시 직접 장소표 1에서 제시한 권장 시간에 따라 RNAse 무료 ddH 2 O에 씻어 짧은 다음 70 % 에탄올 정착액, 가득 50 ML 원뿔 관에.
  3. 냉동 섹션 애벌레 표피의 존재가 아닌 특정 캡처가 발생할 수 있습니다 효율적 LCM 캡 세포 접촉을 방지하여 캡처 효율성을 손상 수 있습니다. 필요한 경우, 조직 섹션에서 표피 선택을 취소한 다음 단계 (4-5)를 실시합니다.
  4. 부드럽게 조직 섹션에 직접 2.5 %의 트립신 50 μl를 피펫하고 실온에서 50~30초 위해 알을 품다. [중요 단계 :이 단계는 최적화가 필요할 수 있습니다. 배양 시간은 microdissected하는 조직과 섹션의 두께에 따라 달라집니다. 짧은 부화가 표피를 제거하는 부족 수 있습니다 반면 더 이상 부화는 관심의 세포를 포함하여 모든 것을 지우 수 있습니다]
  5. 트립신을 제거하고 느슨하게 붙어 표피 조각을 RNAse 무료 ddH 2 O를 포함한 50 ML 원뿔 관에 간단히 섹션을 씻어.
  6. 탈수 과정을 완료하려면 나머지 에탄올과 권장 회 (표 1) 크실렌 솔루션의 각 순차적으로 슬라이드를 찍어.
  7. 탈수 그라데이션 다음, 슬라이드는 간단히 사전 LCM을 수행하기 위해 상온에서 60~120초에 대한 가벼운 공기 흐름에 따라 건조됩니다. [주의 : 사전 LCM을 수행하기 위해 조직 섹션에서 완전히 크실렌을 건조. 크실렌은 microdissection 실패의 결과 LCM 캡 고분자]을 분해하는 것으로 알려져 있습니다.
70 % 에탄올 (정착액) 30-10 초
ddH 2 O 50-10 초
2.5 %의 트립신 보육 50-30 초
ddH 2 O 50-10 초
70 % 에탄올 60 초
95 % 에탄올 60 초
100 % 에탄올 120 초
100 % 에탄올 120 초
100 % 크실렌 120 초
100 % 크실렌 120 초
가벼운 공기 흐름의 공기 건조 60-120 초

표 1 : 냉동 애벌레 조직 섹션의 LCM 탈수 추천 절차.

3. 레이저 캡처 Microdissection

EGFP에 최적화된 플루어 300 epifluorescence 광학 갖춘 PixCell 거짓말 LCM 악기는 LCM을 수행하는 사용되었다.

[중요 단계 : 가능하면 증가로 인해 습도 microdissection 효율에 감소를 방지하기 위해 습도 제어 방안에 microdissection을 수행합니다. 객실 습도 microdissection 효율에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 낮은 방 습도가 발생할 수 있습니다 증가 높은 실내 습도가 낮은 microdissection 효율을 높일 수 있지만, 이외의 특정 캡처의 결과로 정전기 붙다. 우리는 25-50% 상대 습도 조건 사이의 최적의 LCM의 효율성을 달성했습니다.]

  1. 현미경 및 레이저 제어 상자에 전원을 켭니다.
  2. LCM 모자의 두 카트리지를 한 번에 로드할 수 있습니다 HS LCM 모자가 (분자 장치)로 CapSure 캡 홀더 어셈블리를로드합니다.
  3. 분자 장치 소프트웨어를 열고 슬라이드 번호와 캡 로트 번호를 포함하여 실험 세부 정보를 입력합니다.
  4. 캡처 영역에 관련하여 뚜껑의 적절한 위치를 확보하기 위해 PixCell 거짓말 LCM 악기와 조이스틱과 관련하여 정확하게 위치를 향해 카트리지에서 새 HS LCM 뚜껑을로드합니다.
  5. microdissection을위한 현미경의 무대에서 신선한 탈수 애벌레 조직 섹션을 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다.
  6. oculars이나 컴퓨터 화면을 사용하여 찬란 라벨 세포를 찾습니다. : PPK - GAL4, UAS - mCD8의 높은 특이성으로 인해 : GFP 유전자 변형 기자 라인, 클래스 IV 검찰의 뉴런은 쉽게 GFP 형광에 의해 확인할 수 있습니다.
  7. 제목 CapSure HS LCM 대문자를 사용 LCM에 조직 [을 LCM을 악기를 설정 레이저를 초점을 수행하기위한 지침에 대한 자세한 집합에 대한 참조에 22 참조].
  8. 그의 크기 선택한 레이저 스폿의 크기에 해당하는 정확한 녹아 폴리머 자리를 얻을 수있는 "전원"과 "기간"레이저 펄스 매개 변수를 조정합니다. 녹은 고분자 영역의 크기를 사용자 정의 설정을 조정합니다. 다음 매개 변수는 하나의 클래스 IV 다 신경을 microdissecting 사용되었습니다 스팟 직경 7.5 μm의 레이저 강도 30-50 MW, 레이저 시간과 2-4 MS와 1-2 S셀 당 좋아한다이 사용되었습니다. [중요 단계 : 적절한 장소에 필요한 레이저 매개 변수는 조직의 두께 및 객실 습도 조건 다를 수 있습니다. 하나 또는 여러 개의 세포를 microdissecting에 필요한 용해 폴리머 스폿 크기를 달성하기 위해 "전원"과 "기간"설정을 조정합니다.]
  9. 특이성을 극대화하기 위해 최소의 중복과 강한 형광과 세포 microdissect. 각각의 모자는 수많은 세포의 시체를 캡처 할 수 있습니다. [중요 단계 : RNA의 저하를 방지하려면, 이하 45 분까지 탈수 및 microdissection을 포함하여 총 분석 시간을 제한]
  10. 일단 관심의 모든 세포가 붙잡힌, microdissected 세포와 HS LCM 모자를 들고 촬영한 세포의 존재를 확인하고 시각적으로 원치 않는 세포이나 먼지의 존재에 대해 모자를 검사하기 위해 깨끗한 슬라이드에 배치.

4. LCM 파생된 세포에서 RNA 격리

  1. ExtracSure (분자 장치) 장치에 microdissected 세포가 들어있는 뚜껑을 연결합니다. 세포를 포함하는 캡 표면에 RNA 추출 버퍼 (PicoPure, 분자 디바이스)의 12μl를 추가하고 ExtracSure 장치 (GeneAmp, 응용 Biosystems) 거꾸로 얇은 벽의 반응 튜브를 연결합니다. 정렬 트레이 (분자 장치)에 어셈블리를 놓고 부화 블록 (분자 장치) ° C 배양기 안에서 42 미리 가열로 덮개.
  2. 30 분 부화에 따라, 2 분 (X) g 800 추출물이 들어있는 튜브를 원심 분리기. 튜브를 닫고 -80에서 세포 추출물을 저장 ° C를 RNA 정화 준비까지.

PAUSE 포인트

  1. 추출 및 열 PicoPure (분자 장치) RNA 추출 키트의 지시에 따라 RNA 정화. DNAse 치료는 선택 사항이며, 필요에 따라 RNA 정화 동안 열을 수행할 수 있습니다. 필요한 경우, 여러 LCM 샘플은 최종 RNA 수율을 향상시키는 하나의 열에 정화 동안 함께 풀링 수 있으며, 용출 버퍼의 작은 볼륨 (11-30 μl) (PicoPure, 분자 장치)에 eluted 수 있으며, -80에 저장 사용 ° C까지 준비. 원하는 경우 1 μl 나누어지는는 Bioanalyzer 2100 (애질런트 테크놀로지 주식 회사)에서 총 RNA의 품질을 평가하기 위해 사용할 수 있습니다.

대표 결과

레이저 캡처 microdissection (LCM)은 세번째 instar의 애벌레 (그림 1)에서 하나의 클래스 특정 또는 여러 Drosophila 검찰의 뉴런을 분리하는 데 사용되었다. LCM은 Drosophila DA 신경 세포 기관 (그림 2A - C)의 격리 정밀도와 특이성 높은 학위 수 있습니다. 또한, 이러한 절연 다의 뉴런에서 정화 총 RNA는 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사) (그림에 대한 분석을 할 때 날카로운 5.8S, 18S 및 28S ribosomal RNA의 봉우리의 존재로 표시로서 우수한 품질의 것을 알았습니다 2D).

우리 고립된 세포의 연결을 특정 농축을 평가하기 위해 우리는 유전자의 연결을 특정 마커, elav를 사용하여 실시간으로 양적 역방향 전사 PCR (qRT - PCR)을 수행. qRT - PCR 분석을 위해, 우리는 우리의 내생적인 컨트롤 (rp49)의과 ΔΔCt 방법 23을 사용하여 전체 유충으로부터 격리 총 RNA에 상대적으로 검찰의 뉴런과 표준이 표현 microdissected LCM에 elav 표현의 상대적 수준을 계산. 이러한 분석은 LCM에 elav의 상대적인 수준의 2.5 배 농축을 통해 공개 마이크로 해부 전체 동물 (그림 3)에 비해 다 신경 세포 샘플을.

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그림 1 : Drosophila 주변의 뉴런의 LCM. (A) 연령 일치 셋째 instar의 애벌레는 선택 씻어 및 (B) OCT와 cryomold에 포함된하고 -80에서 냉동 ° C, (C) 8μm 시리얼 조직 섹션은 표준 그라 이오 스탯를 사용하여 만든 있으며, (D)에 균일하게 배치됩니다 깨끗한 유리 슬라이드. 부착된 조직 섹션 유리 슬라이드는 -80에서 저장 ° C 이전 LCM 처리. (E, F) 70 % 에탄올에 즉시 LCM 앞에, 조직 섹션이 해동되고 간단히 고정 간단한 ddH 2 O.에서 헹굼 다음 (G) 슬라이드는 간략하게 크실렌의 트립신과 incubated과 애벌레 섹션. (H, I) 조직 섹션 애벌레 표피없이에서 손톱 (검은색)을 제거하는 ddH 2 O와 씻어서 다음 에탄올 기울기에 더욱 건조하고 마지막으로 지워집니다 thermolabile 중합체와 함께. (J) LCM 모자는 조직 섹션에 배치되며 레이저 선택한 형광 세포 몸에 펄스입니다. 레이저 펄스는 폴리머를 녹아 선택한 셀 본체 먹기. 캡처 세포 본체와 함께 고분자 캡은 해제하고, (K)입니다 RNA 추출 버퍼는 세포에 추가됩니다. RNA 추출 버퍼와 함께 촬영한 세포는 30 분 동안 42 ° C에서 incubated이며 어느 -80에 저장할 수 있습니다 ° C, 또는 직접 RNA 정화를위한 처리.

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그림 2 : LCM은 검찰의 뉴런의 고정밀 캡처를 용이하게합니다. : GFP 기자 스트레인 : (A) 탈수 및 트립신의 대표 이미지는 PPK - GAL4하여 GFP와 함께 레이블이 클래스 IV DA의 뉴런, UASmCD8를 보여주는, 이전에 수행 LCM 8 마이크론 조직 섹션을 처리. 참고 뉴런 중 하나가 캡쳐 (화살촉) 강조 표시됩니다. (b)는 강조 신경 세포 (화살촉)의 셀 몸이 깔끔하게 조직 섹션에서 높은 특이성과 마이크로 - 해부하는 것입니다. 단일 클래스 (C) 최종에서보기 - IV 다 신경 세포는 LCM 뚜껑에 캡처한. 샤프 5.8S, 18S의 존재로 표시로서 우수한 RNA의 품질을 보여주는 LCM - 파생 DA의 뉴런에서 분리된 총 RNA의 (D) 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사) electropherogram 및 28S rRNA의 봉우리.

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그림 3 :. qRT - PCR은 전체 동물에 비해 검찰의 뉴런을 잡았 LCM에의 연결 마커 유전자 발현의 실질적인 강화를 보여 LCM에 신경 세포 특정 마커 유전자 발현 (elav)의 qRT - PCR 분석은 다 신경을 (21 - 7 - GAL4, 캡처 UAS - mCD8 : GFP)과 전체 동물이 시대에 일치 셋째 instar의 애벌레는 세중의로 진행되었습니다. LCM 캡쳐 DA 뉴런의 elav 표현의 상대 수준은 내생 컨트롤 (rp49)와 ΔΔCt 방법 23을 사용하여 전체 애벌레에 상대적으로 정상화되었습니다. LCM에 elav의 상대적인 수준의 2.5 배 농축은 DA 신경 세포 샘플이 전체 동물에 상대적으로 관찰되었다 캡처.

문제 해결

문제 : 낮은 품질의 저하, 또는 RNA.

실험을하는 동안 RNAse 무료로 상태를 확인합니다. 30 분 슬라이드 당 LCM에서 보낸 시간 양을 줄여보십시오. LCM을 수행하는 경우를 제외하고 드라이 아이스에있는 슬라이드 및 샘플 보관하십시오. 그들이 절단되면 조직 섹션을 해동하지 마십시오.

문제 : 대부분의 세포는 트립신 처리 (17-18 단계) 동안 슬라이드에서 손실됩니다.

트립신 처리 시간을 줄여보십시오. 트립신 농도를 줄여보십시오.

문제 : 뚜껑 고분자의 표피 및 기타 비 - 특정 조직 파편의 존재.

접착제 노트 22 볼품없는 측면과 폴리머 표면을 모래 바닥으로 조직 파편을 제거하십시오.

문제 : 낮음 LCM 효율성.

100 % 에탄올과 xylenes에서 배양 시간을 늘려보십시오. 제습기를 사용하여 실내 습도를 줄입니다.

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토론

여기에 제시 프로토콜은 LCM을 통해 Drosophila 주변 뉴런의 격리를위한 최적화된 방법을 설명합니다. 이 LCM 프로토콜이 개발의 세 번째 instar 애벌레 단계에서 단일 클래스의 특정 또는 여러 Drosophila 검찰의 뉴런의 구체적인 격리를 위해 설계되었습니다 동안, 프로토콜의 사소한 변경 사항은 즉시 모든 개발에서 다른 Drosophila 셀 유형의 캡처에 맞게 수 서로 다른 GAL4를 사용...

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공개

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 말

우리는 DRS 감사합니다. LCM 도움이 연구에 사용된 비행 주식, 그리고 버지니아 Espina 박사 엠마누엘 Petricoin 박사 랜스 Liotta를 제공 Yuh - Nung 월 및 웨스 Grueber. 저자는이 연구의 지원 (DNC)와 조지 메이슨 대학 프로보의 사무소 (EPRI)에 대한 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념 트러스트를 인정합니다.

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자료

장비 :

  • 그라 이오 스탯
  • 슬라이드 고정, rinsing, 트립신 치료 및 에탄올 / 크실렌 탈수 50 ML 원뿔 관
  • -80 ° C의 냉동고
  • 보육기
  • PixCell 거짓말 LCM 악기는 플루어 300 epifluorescence 광학은 EGFP (분자 장치 - 분자 장치)에 최적화된

참고문헌

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