活性骨髄由来マクロファージとBradyzoite条件におけるトキソプラズマのシスト壁形成

要約

トキソプラズマ原虫は、組織培養モデルで模倣することができる環境ストレスに応答して嚢胞フォームに変換します。このビデオでは、骨髄由来のマクロファージや線維芽細胞の変化、増殖培地のpHを活性化することにより、嚢胞壁の形成を調べるためのテクニックを示しています。

要約

トキソプラズマ原虫は、温血動物の任意の有核細胞に侵入することができる偏性細胞内寄生体である。感染中に、T.原虫は tachyzoiteと呼ばれる高速な複製形態として発信しています。タキゾイトはよく特徴付けされていないシグナル伝達過程でbradyzoiteと呼ばれる成長が遅い被嚢の形に変換する。動物の中で、bradyzoite嚢胞は中枢神経系と筋肉組織で発見し、感染症の慢性期を表しています。 bradyzoitesへの変換は、高pH、またはインターフェロンγ（IFNγ）の添加により培地を用いて、CO ₂飢餓による組織培養でシミュレーションを行うことができます。 Bradyzoitesは、レクチンがDolichos biflorus凝集素（DBA）が結合する嚢胞の壁の存在によって特徴付けられる。蛍光標識されたDBAは、低CO ₂と高pHの培地にさらされたヒト包皮線維芽細胞（HFFs）で成長させた寄生虫の嚢胞壁を可視化するために使用されます。 BMMsがIFNγとリポ多糖（LPS）で活性化された後、同様に、内に存在する寄生虫は、マウス骨髄由来マクロファージ（BMMs）は、DBAによって検出可能な嚢胞壁が表示されます。このプロトコルは、Tの変換を誘導する方法を紹介します低CO ₂とBMMsの活性化と高pHの増殖培地を使用してbradyzoitesに原虫 。宿主細胞は、カバースリップ上で培養タキゾイトに感染し、どちらかのIFNγとLPS（BMMs）の添加により活性化または三日間高pHの増殖培地（HFFs）に公開されます。感染症が完了すると、宿主細胞は、固定透過性、およびブロックされます。嚢胞壁は、蛍光顕微鏡とローダミンのDBAを使用して視覚化されます。

プロトコル

1。ヒト包皮線維芽細胞（HFF）でコーティングされたカバースリップの準備

1. 24ウェル組織培養プレートのウェルの底に滅菌円形のガラスのカバースリップを配置。
2. コンフルエント150センチメートル²フラスコからHFFsを回収するために、1 × PBSで2回フラスコを洗い、0.025％トリプシン- EDTA 2.5 mlを加える。 ℃で5〜10分間37℃でフラスコをインキュベートする。
3. 手のひらに対してフラスコの側面をタップすると、フラスコから細胞を切り離すに役立ちます。細胞がフラスコから放出したら、HFF培地（ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM] 10％のFBS、2mMのL -グルタミン、及び1％ペニシリン - ストレプトマイシン）の150mlを追加し、フラスコを洗浄し、収集する培地を使用して細胞。
4. カバースリップとウェルあたりの細胞を1 mlを分注する。
5. 細胞は37℃、5％CO ₂コンフルエントになることができます。

2。 BMC開発のためのL929条件培地（CM）を準備

1. L929は、コンフルエントの長い期間の後に刺激因子、マクロファージコロニーを分泌するマウス異数体の線維肉腫細胞株です。この分泌は、細胞培養¹のマクロファージにマウスの骨髄細胞を開発するために使用するL929細胞からのCMが可能になります。
2. L929細胞がコンフルエントになれば、彼らは球状に表示され、フラスコを持ち上げ始めるまで、彼らは追加の7から9日間インキュベートてみましょう。上清とペレットを10分間425 xgで任意の剥がれた細胞を集める。この上清はCMです。
3. L929細胞の一つ150センチメートル²フラスコは、BMCの培地150mlを生成するCMの30mlを、得られます。 BMC培地を10％FBS、DMEMに20％のCM、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、および1％L -グルタミンで構成されています。

3。骨髄とBMCの細胞培養の分離

1. CO ₂窒息と表面を70％エタノールで消毒して、1つC57BL / 6マウスを生け贄に捧げる。
2. 足の近くに腹部の皮膚を持ち上げ、ハサミで切断して腹膜を公開。腹膜腔を穿刺することは避けてください。脛骨と大腿骨を露出させる足に減らす。はさみを使って脚の骨から筋肉組織をカット。
3. 大腿骨を削除するには、一度膝の下に、一度腰の近くにカット。冷1X PBSを含む細菌ペトリ皿に骨を置きます。 BMCは恒久的に付着するので、これらのステップのためのペトリ皿を扱う組織培養を使用しないでください。余分な筋肉組織を掻きにメスを使用してください。骨髄を公開するだけで膝の上に骨を切る。
4. リピート工程（b）と（c）第2大腿骨から骨髄を収集する。
5. 冷1X PBS及び50 mlコニカルチューブに骨髄を取り除くために25ゲージの針で満たされた10ccの注射器を使用してください。骨は、純粋な白色度骨髄が削除され表示されます。
6. どんな骨髄凝集体を分割するために22ゲージの針を通してPBS /骨髄の混合物を渡します。
7. 10分間425 × gで混合物を回転させ、上清を取り除く。
8. BMCの培地8 mlにペレットを再懸濁する。 8細菌ペトリ皿に細胞懸濁液と9ミリリットルのBMC培地1mlを追加。
9. 37℃、5％CO _2。
10. 5日目に、各プレートに10ミリリットルのBMC培地を加える。 7日目までに、細胞は完全に開発される。 BMCは、成熟後1-2週間継代培養することができます。
11. BMCが分割するには、培地を除去し、各シャーレに冷1 × PBS 5 mlを加える。 4℃でインキュベート℃で30分間を、細胞は持ち上げる始めるまで。無菌トランスファーピペットを用いてプレートからするBMCをすすぐ。
12. 10分間、425 × gで50 mlコニカルチューブとペレットのプールBMCが。
13. 10ミリリットルのBMC培地と血球計でカウントにペレットを再懸濁する。底の丸いガラス製カバースリップで24ウェルプレートにウェル当たり2 × 10 5シードBMCは。 BMCははT.で感染する前に一晩付着してみましょう原虫。超過BMCは、後で使用するためのペトリ皿に播種することができます。

4。 T.と感染細胞トキソプラズマ原虫

1. 2 × 10 ⁶ TでコンフルエントHFFsの25cm ^2のフラスコに感染原虫と細胞が溶解し始めるまでに成長（約2〜3日）。
2. 組織培養フラスコから感染した宿主細胞の単層を除去するために、セルスクレーパーを使用して、その後、27ゲージの針を通して外れた単分子層を渡すことによって、宿主細胞から寄生虫を離します。
3. 培地中の寄生虫の数を決定するために血球計数器を使用してください。
4. プロトコル1、またはプロトコル3からBMCはからHFF単分子膜のカバーで、ウェル当たり10 ⁵寄生虫に感染する。寄生虫は、37℃で3時間に侵入° C、5％CO _2をしましょう。

5。 T.を開始環境ストレスによる原虫 bradyzoite開発

1. 培地のpHの上昇とCO ₂飢餓とHFFsでBradyzoiteの開発
   1. 開発の培地を準備する。開発の培地には、RPMが含まれています私炭酸なしの1640、1％FBS、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、および42 mMのHEPES。 〜8.0と殺菌フィルター。
   2. 感染HFFsからDMEMを除去、1X PBSですすぎ、および開発の培地を1mlを加える。
   3. 周囲の空気を37℃で3日間Cインキュベートする。
2. BMCの活性化
   1. BMCが活性化するメディアを準備します。アクティベーション培地は、100U/mlのIFN -γおよび100 ng / mlのLPSを添加したBMCの媒体です。凝集を妨害するために使用する前に2分間水浴でLPSを超音波処理してください。
   2. 井戸からBMC培地を除去し、活性化培地1mlで交換してください。
   3. 37℃、3日間5％CO _2を 。

6。免疫蛍光検出

1. 1X PBSでウェルを三回感染リンス。
2. 20分間3％ホルムアルデヒドの200ulで単層を修正。
3. 固定液を取り出して、1 × PBSをウェルの中にすすいでください。
4. ウェルに0.1 Mグリシン200μlのを追加し、5分間放置します。
5. グリシンを削除し、1X PBSでウェルをリンス。
6. 30分間単分子層を透過し、ブロックするために3％の250μlのBSA/0.2％1X PBSでTritonX - 100を追加。
7. ブロッキング溶液を除去し、1 × PBSでウェルを洗ってください。
8. BSA/0.2％のトリトンX - 100 1X PBSで3％ローダミンDolichos biflorusアグルチニンの1:250希釈の50μlを追加。
9. 1時間室温でプラットフォームシェーカー上プレートと場所をカバー
10. 0.2％のカバーグラスを3回洗浄トリトン各プラットフォームシェーカー上で5分間、1 × PBSでX - 100。
11. 4'6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）を含むVectaShieldマウンティング培地を使用してマウントカバースリップ。
12. ステンドT.トキソプラズマは、100倍の倍率でローダミン用のフィルターを適切な蛍光顕微鏡を用いて可視化することができます。

7。代表的な結果

図1は、Tの代表的なDBAの染色を示しています。 pHのストレス下で活性化さBMMsとHFFsの原虫 。寄生虫の周りの両方のshowのDBA染色は、嚢胞壁成分の存在を示す、空胞を含む。アクティブBMMイメージは液胞の表面と一致しているDBA染色を示す。 T.の断面pHの原虫は HFFsはステンドのない内部構造を持つ嚢胞壁を示して強調した。

図1。ストレスT.のDBA染色ストレス状態、活性化BMMsまたはpH下で原虫。細胞内寄生虫は、HFFsを強調したローダミン共役DBA（赤）で染色した。微分干渉コントラスト（DIC）は、嚢胞の概要を示すと黒のスケールバーは2μmに等しくなります。

動物実験

動物実験は、ウィスコンシン大学の動物実験委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

ディスカッション

T.のbradyzoiteの発展のメカニズムは完全には理解されていませんが、分子遺伝学的解析組織培養における原虫のステージの変換には、bradyzoite嚢胞形成^2,3,4に関与する遺伝子の発見につながっている。分析はまた、いくつかのbradyzoiteマーカーは活性化マクロファージ^5,6の成長を含む他の長引くストレス状態で発現されるという観察につながった。上記の方法では...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	GIBCO, by Life Technologies	11960-051
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	heat inactivate
Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin	Vector Laboratories	RL-1032
Formaldehyde (16%)	Polysciences, Inc.	18814
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
IFNγ	PeproTech Inc	315-05	Store in single use aliquots
L-glutamine (200mM)	GIBCO, by Life Technologies	25030
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma-Aldrich	L4391-1MG	Store in single use aliquots
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate)	GIBCO, by Life Technologies	31800-022
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO, by Life Technologies	25200
VectaShield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200