修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

要約

mStrawberry OP9細胞は共培養からすべてのES由来の子孫の完全な評価が可能になります。

要約

生体内および胚lethalitiesを扱うことなく、造血に関与する最も早い遺伝子を特徴づけるためのアクセスが困難な細胞集団を研究するときに造血細胞の運命に向かってES細胞のin vitroにおける分化と便利です。 OP9ストローマ細胞株が機能的なM - CSFを欠いている大理石骨病変異マウスの頭蓋冠から派生しているとしてES/OP9共培養系は、もともと、マクロファージの過剰産生することなく、造血子孫を生成するように設計されました。 体外 ES/OP9共培養系における初期造血発展を再現するために使用することができます。 OP9ストローマ細胞上で培養した場合、ES細胞は、FLK - 1 + hemangioblasts、造血前駆細胞、そして最終的に成熟し、最終分化の系統に分化する。標準ES/OP9共培養プロトコルは、OP9細胞のコンフルエントな層の上にES細胞の配置を伴う;だけでなく、定期的な再播種の手順を古い除去するためには、OP9細胞を汚染する。さらに、現在のプロトコルは、造血細胞懸濁液中に発見され、分化の毎日で、ES由来の子孫の評価用に最適化されていないを評価伴います。しかし、再播種ステップとだけ浮遊細胞の収穫では、ある者は、潜在的にES由来の子孫と発展途上造血細胞の大部分をミス。この問題は、ノックアウトESラインに関連付けられている造血欠陥を特徴付けるしようとしたときに対処することが重要になります。ここでは、ダウンストリームアッセイからOP9細胞を汚染の除去を可能にする改変ES / mStrawberry OP9共培養を、説明します。このメソッドは、より直接的に胚内で観察された造血分化のパターンに対応する造血分化のパターン、その結果、共培養のすべての日ですべてのES由来の子孫を完全に評価することができます。

プロトコル

1。 ES細胞の調製

1. 特定の細胞株のための標準プロトコルにしたがって培養ES細胞。 0日目のためのmStrawberry OP9細胞の上にプレートするのに十分なES細胞を準備することを確認してください（ES細胞は、0日目に1cm ²当たり1 × 10 ^ 3細胞で播種されます）

2。 OP9細胞の調製

1. mStrawberry OP9細胞を成長する前に、OP9増殖培地を準備
   OP - 9細胞培養培地
   

   	在庫切れ	最終濃度。	量（mL）
   aMEM			39.5
   FBS（OP - 9テスト済み）	100パーセント	20パーセント	10
   L -グルタミン	100X（200mmの）	2mMの	0.5
   			50mLの

   
   準備の一週間以内に4℃と使用
2. mStrawberry OP9細胞を維持するために、メディアは2日ごとに変更する必要がありますし、細胞を前に（コンフルエント70から90パーセントで、サブカルチャー）コンフルエントに達した細胞の継代培養することがあります。 mStrawberry OP9細胞培養を越え​​て成長されることはありませんこのようなコンフルエント90％が脂肪細胞への分化になります。図3を参照してください。
   1. PBSで2倍の洗浄細胞による継代培養細胞（またはPBSで1 ×トリプシン- EDTAで+ 1 × 0.1％）
   2. 37 予め温めておいた 0.1パーセントトリプシン- EDTAを追加℃で5分間（または細胞デタッチされるまで）
   3. 細胞がはがれるしたら、OP - 9増殖培地を加える。 50mLのコニカルチューブに細胞を移す。
   4. 室温で5分間、300 xgで細胞をペレット化は。 上清を廃棄。
   5. 新鮮なmStrawberry OP9増殖培地に懸濁し
   6. 10 ⁴細胞/ cm ²の最小密度で細胞をプレート
   7. 共培養したES細胞（0日、5日目、または実験のDay8 / 9）のために必要な日の前に3日間出発コンフルエントにmStrawberry OP9細胞を成長させる

3。 ES / mStrawberry OP9共培養

1. 共培養の分化のメディアを準備します。
   

   	在庫切れ	最終的な	量（mL）
   aMEM			39.5
   FBS	100パーセント	20パーセント	10
   L -グルタミン	200mmの	2mMの	0.5
   			50mLの

2. mStrawberry OP9細胞（デイ-3）
   1. 常にその日-3でOP9細胞では、共培養の0日のためのmStrawberry OP9細胞のコンフルエントな層を持つように、サブカルチャー。図4bを参照してください。 0日目でコンフルエントのための1 × 10 ⁴ / cm ²のプレートmStrawberry OP9細胞。 5日目と共培養の継続のため8日目/ 9サブカルチャーの余分な細胞にしてください。
3. ES / mStrawberry OP9共培養のセットアップ（0日）
   1. PBSで2倍のES細胞を洗浄
   2. 5分@ 37℃インキュベート、予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAでES細胞をトリプシン処理
   3. 細胞に共培養分化のメディアを追加します。
   4. 400xgでペレットES細胞、5 - 7分、RT。上清を捨てる
   5. 共培養分化培地中で細胞を再懸濁し
   6. mStrawberry OP9細胞からメディアを削除する
   7. mStrawberry OP9フラスコに共培養分化のメディアを追加します。
   8. mStrawberry OP9細胞のフラスコにプレート1 × 10 ³ ES細胞/ cm ^2である 。 37細胞をインキュベート° C、湿度5％CO _2を 。
4. mStrawberry OP9細胞（2日目）
   1. サブカルチャーのmStrawberry OP9は、そのためには、共培養の5日目のためのmStrawberry OP9細胞のコンフルエント層を持っている。 5日目でコンフルエントのための1 × 10 ⁴ / cm ²のプレートmStrawberryはOP9細胞（ステップ3.2として）。 8日目/ 9、必要に応じて（ステップ2.2のように）のためのサブカルチャーの余分な細胞にしてください。
5. ES / mStrawberry OP9共培養（3日目）
   1. 慎重に共存培養から培地を除去し、新鮮な共培養分化培地に交換してください

6. ES / mStrawberry OP9共培養（5日目）

   1. 慎重にPBSで2倍の共培養を洗う
   2. 予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAで細胞をトリプシン処理
   3. 共培養の分化メディアを使用してフラスコから細胞を洗浄
   4. 400xgで細胞をペレット化、7分、RTは。 上清を廃棄
   5. 細胞に共培養分化のメディアを追加します。細胞を再懸濁させると、単一の細胞懸濁液のために確保するために21ゲージbluntended針を使用して、
   6. 血球計算板を用いて細胞を数える。 0日目からのES細胞の数が100から150倍に増加している必要があります。
   7. 再シード6.48x10 ⁴ / cm ^2と -コンフルエント、mStrawberry OP9細胞の新しい層の上に7.76x10 ⁴ / cm ^2と共培養細胞
   8. 5日目アッセイ - 残りの共培養細胞はフローサイトメトリー分析、cytopreps（30K細胞）、ChIPアッセイなどに使用することができます。
7. ES / mStrawberry OP9共培養（日目8 / 9および12日目）
   1. フラスコから分化のメディアを取り外し、保管します。懸濁液中の造血細胞を除去するためにPBSで洗浄単層1xは。 造血細胞を放り出すしないでください。
   2. 予め温めておいた 0.25％トリプシン- EDTAで接着細胞をトリプシン処理
   3. ESの分化のメディアとのフラスコから細胞を洗浄し、サスペンション=で見つかった造血細胞に加える
   4. 400xgで細胞をペレット化、7分、RTは。 上清を廃棄
   5. 細胞に共培養分化培地またはPBSを追加。細胞を再懸濁させると、血球計数器を用いて、単一の細胞懸濁液のカウントの細胞のために確保するために21ゲージbluntended針を使用してください。
   6. 共培養は、12日目に再び8日または9で合流、mStrawberry OP9細胞の新しい層の上に再播種共培養細胞がより成熟した造血前駆細胞を評価し、14日間継続することができます。検定の日に必要な細胞の回復に基づいて再シード最適化されたセルの数。
8. ES由来の子孫（日1-14）の評価。 ES由来の子孫はmStrawberry陰性細胞（ES由来の子孫）選別の流れによって共培養のどの曜日でも評価することができます。
   1. フラスコから分化のメディアを取り外し、保管します。懸濁液中の造血細胞を除去するためにPBSで単層1 ×を洗ってください。造血細胞を投げてはいけません。
   2. 予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAで接着細胞をトリプシン処理
   3. 共培養の分化のメディアとのフラスコから細胞を洗浄し、懸濁液に見られる造血細胞に加える
   4. 400xgで細胞をペレット化、7分、RT。上清を捨てる
   5. 21ゲージbluntended針とカウントで再懸濁し、細胞
   6. ES由来の子孫は、（mStrawberry陰性細胞）mStrawberry正OP9細胞からソートされたフローすることができます。 ES由来の子孫は、その後、フローサイトメトリー解析、cytopreps、ChIPアッセイ、等によって特徴付けることができます。

4。代表的な結果：

図1。 ES / mStrawberry OP9共培養系。私たちの研究室では造血開発をモデル化するためにin vitroで ES細胞共培養系で使用しています。 mStrawberry OP9細胞のコンフルエントな層に配置する場合は、この共培養系では、ES細胞は、Day5でhemangioblastsに、分化する。分化した造血系統は14日目で見えるけれども共培養が進行すると、造血前駆細胞は、8日目で存在している。必要にmStrawberry OP9細胞の新たな融合性層の上に、ES由来の子孫を継代するときの矢印は、分化の日数を示している。

図2。適切なES細胞の分化 。 ES細胞は、0日mStrawberry OP9のコンフルエント層上に播種されています。 ES由来の子孫は、ES由来の子孫が定義されている境界線を持つ細胞のクラスターのように見えるか渦巻きパターンを形成し始めて、分化の3日目で見えるようになるし始める。 5日目で細胞の渦巻きを積み上げたとして内皮および造血系統のための一般的な中胚葉前駆体であるHemangioblastsは、表示されるはずです。五日以上の共培養の期間については、ES由来の子孫は、造血細胞のクラスターとして表示されます。 2〜4単細胞のクラスターは、日6月7日で、表示されるはずと共培養の8 / 9日間で大規模な細胞クラスターに成長する。他のES由来の子孫にもしっかりと接着間質細胞層にバインドされ見られる。

図3。失敗したES細胞の分化。この共培養の結果から、不適切なES細胞の分化を反映している。 ES由来の後代が5日目で渦巻き模様に表示されていないか注意してください。渦巻き模様の細胞の欠如は、不適切な血管芽細胞の形成を示している。血管芽細胞が正常に発達しない場合には、共培養の継続は、発育を妨げ造血系の細胞分化になります。不適切な血管芽細胞の形成を伴う共培養は破棄されるべきである。

図4。 mStrawberry OP9細胞培養。（）mStrawberry OP9細胞がで継代培養されていますコンフルエントに70から90パーセント。 （B）適切な分化、ES細胞やES由来の子孫はmStrawberry OP9細胞の過度に密集​​層の上に配置されます。

図5。代表的なES / mStrawberry OP9共培養フローのプロファイル。すべてのES由来の子孫はmStrawberry陰性細胞であるとmStrawberry OP9細胞からソートされたフローすることができます。 mStrawberry陰性細胞のゲートは、従来のES/OP9共培養を用いて決定した。

ディスカッション

共培養の5日目におけるFlk1 +のhemangioblastsの生産でmStrawberry OP9細胞の結果のコンフルエント層上にES細胞の適切な分化。 Hemangioblastsは、図1に観察された細胞の渦巻きを、積み上げた表示されます。共培養の残りの部分では、目に見えるES由来の子孫は、造血細胞のクラスター（図1）として表示されます。 Day6 / 7二から四時に細胞クラスターが表示され、その共培養の8 / 9日間で大規模な細胞クラスター（接着及び懸濁液中の両方）に成長する。他のES由来の子孫にもしっかりと接着間質細胞層内にバインドされていますされています。

プロトコールに記載されていないものの、それは、FBSは、ESの増殖培地、mStrawberry OP9増殖培地およびES / mStrawberry OP9分化のメディアで使用される事前テストに不可欠です。適切にテストされた血清は、分化の5日目までは、共培養におけるES細胞の適切な分化をmStrawberry OP9細胞の適切な成長を確保するだけでなく、してください。代替として、またはmStrawberry OP9細胞に加えて、OP9細胞は、前（7.8x10 ⁴細胞/ cm ^2）コンフルエントで播種する、8000ラドで、照射することができる。 OP9細胞の照射は、繰り返し再播種ステップの排除を可能にする、だけでなく、下流のアッセイからOP9細胞を汚染、古いのほぼ完全な排除が可能になります。

OP9細胞は、CMVプロモーターの制御（pRRLsin - CMVベクター、UCLAベクトルコア）の下にレンチウイルスベクターを発現するmStrawberryの3ug/mLとOP​​9細胞を形質導入することによってmStrawberryタンパク質を発現するように設計されました。

標準ES/OP9共培養のプロトコルは、細胞の継代からOP9細胞を汚染し、古い減らすために、同様に、コンフルエント層OP9細胞上に5日目再播種のステップをES細胞の配置を伴う。さらに、懸濁液中に見られるだけ造血細胞は、ES由来の子孫を評価するために削除されます。しかし、再播種ステップとだけ浮遊細胞の収穫両方では、ある者は、潜在的に開発し、ES由来の造血細胞のかなりの数をミス。この問題は、ノックアウトESラインに関連付けられている造血欠陥を特徴付けるしようとしたときに対処することが重要になります。この問題を回避するために、私たちの研究室はmStrawberry発現OP9細胞を使用して、修正された共培養を使用。これは、すべてのESの子孫は5日目、およびダウンストリームアッセイのためのすべてのES由来の子孫の収穫のために継続的に共培養するために転送されることを保証します。この変更は、ヒトとマウスのESラインの両方に由来する造血子孫の評価および特性評価に便利なツールを提供しています。

様々な段階プリミティブと決定的な造血このES - mStrawberry OP9共培養モデルを反復する。造血開発の初期段階の研究に、多くの人々は、ES細胞から血管芽細胞の発達を評価するBL - CFC（コロニー形成細胞ブラストのような）アッセイを、使用してください。初期造血開発を調査する際BL - CFCアッセイはmStrawberry - ESの共培養システム、便利なツールですが、それは血管芽細胞の評価を可能にするため、同様に、より多くの成人の造血系統を増加ユーティリティを示す。

伝統的なOP9/ESとEBの分化プロトコルを使用して前の仕事は、HoxB4の過剰発現など、多分必要な追加の因子がin vitroでの長期的なデータの再読込み造血幹細胞を導出するためにことを示している。追加作業はmStrawberry負、ソートされたES由来の集団が、真の造血幹細胞が含まれているかどうか評価する必要がある。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
aMEM	インビトロジェン	12571-063
FBS	オメガサイエンティフィック	FB01	事前テスト
L -グルタミン	Cellgro	25から005 - CI	200nmの
トリプシン- EDTA	セル技術を幹	07901

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
aMEM	インビトロジェン	12571-063
FBS	Hyclone	SH30070	事前テスト
L -グルタミン	Cellgro	25から005 - CI	200mmの
PBS（のCa 2 +及びMg 2 +なし）	Cellgro	21から031 - CV
トリプシン- EDTA	セル技術を幹	07901