Modificato ES / OP9 Co-Cultura Protocollo prevede Caratterizzazione avanzata di Progeny emopoietiche

Riepilogo

mStrawberry OP9 cellule permettere una valutazione completa di tutte le ES-derivati ​​dalla progenie di co-coltura.

Abstract

La differenziazione in vitro di cellule staminali verso un destino di cellule ematopoietiche è utile quando si studiano popolazioni di cellule che sono di difficile accesso in vivo e per caratterizzare i primi geni coinvolti nella ematopoiesi, senza avere a che fare con lethalities embrionale. Il ES/OP9 co-coltura sistema è stato originariamente progettato per produrre progenie ematopoietiche, senza la produzione su dei macrofagi, come il OP9 linea di cellule stromali deriva dal calvaria di topi mutanti privi di osteopetrosi funzionale M-CSF. In vitro ES/OP9 co-coltura sistema può essere utilizzato al fine di ricapitolare primo sviluppo ematopoietiche. Quando OP9 coltivati ​​su cellule stromali, cellule staminali si differenziano in Flk-1 + emangioblasti, progenitori emopoietici, e finalmente maturo, lignaggi terminalmente differenziate. Lo standard ES/OP9 co-coltura protocollo prevede l'inserimento di cellule staminali embrionali su uno strato confluente di OP9 cellule, così come, a pochi passi replating periodici al fine di rimuovere vecchi, contaminando OP9 cellule. Inoltre, i protocolli attuali coinvolgono valutare solo le cellule ematopoietiche si trovano in sospensione e non sono ottimizzati per la valutazione di ES-derivati ​​della progenie per ogni giorno di differenziazione. Tuttavia, con passi replating e la raccolta di cellule in sospensione una sola manca potenzialmente una grande porzione di ES-derivati ​​progenie e lo sviluppo di cellule ematopoietiche. Questo problema diventa importante affrontare quando si cerca di caratterizzare i difetti ematopoietiche associati a linee ES eliminazione diretta. Qui si descrive una versione modificata ES / mStrawberry OP9 co-coltura, che consente l'eliminazione dei contaminanti OP9 cellule di test a valle. Questo metodo permette la valutazione completa di tutti gli ES-derivati ​​della progenie per tutti i giorni di co-cultura, risultando in un modello di differenziazione ematopoietiche, che più direttamente corrisponde al modello di differenziazione ematopoietiche osservate entro l'embrione.

Protocollo

1. Preparazione di cellule ES

1. Coltura delle cellule ES in base al protocollo standard per la linea cellulare particolare. Assicurati di preparare le cellule ES abbastanza sul piatto della mStrawberry OP9 cellule per il giorno 0 (cellule ES sarà placcato a 1x10 ^ 3 celle per cm ² al giorno 0)

2. Preparazione delle cellule OP9

1. Prima di crescita mStrawberry OP9 cellule, preparare il terreno di coltura OP9
   OP-9 celle Media Cultura
   

   	Stock	Conc finale.	Volume (ml)
   aMEM			39,5
   FBS (OP-9 testato)	100%	20%	10
   L-glutammina	100X (200mm)	2mM	0,5
   			50mL

   
   Conservare a 4 ° C e utilizzare entro una settimana di preparazione
2. Al fine di mantenere mStrawberry OP9 cellule, i media devono essere cambiati ogni 2 giorni e le cellule devono essere subcoltura prima di raggiungere le cellule confluenza (sottocultura al 70-90% confluenza). mStrawberry OP9 colture cellulari non sono mai cresciuta oltre il 90% confluenza come questo si tradurrà in loro differenziazione in adipociti. Vedere la Figura 3.
   1. Cellule subcultura da parte delle cellule 2X lavaggio con PBS (o 1x con PBS + 1x 0,1% con tripsina-EDTA)
   2. Aggiungi preriscaldata 0,1% tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 minuti (o fino a staccare le cellule)
   3. Quando le cellule sono staccati, aggiungere OP-9 mezzo di crescita. Trasferire le cellule in una provetta da 50mL conica.
   4. Cellule pellet a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Gettare il surnatante.
   5. Risospendere le cellule in fresco mStrawberry OP9 terreni di crescita
   6. Cellule piastra ad una densità minima di 10 ⁴ cellule / cm ²
   7. Crescere mStrawberry OP9 cellule a confluenza a partire dal 3 giorni prima del giorno necessario per co-coltura di cellule staminali embrionali (giorno 0, 5 ° giorno, o 8 ° giorno / 9 dell'esperimento)

3. ES / mStrawberry OP9 Co-cultura

1. Preparare Co-cultura mediatica differenziazione
   

   	Stock	Finale	Volume (ml)
   aMEM			39,5
   FBS	100%	20%	10
   L-glutammina	200mm	2mM	0,5
   			50mL

2. mStrawberry OP9 cellule (Giorno -3)
   1. SEMPRE Subculture OP9 celle -3 ° giorno, in modo da avere strati confluenti di cellule mStrawberry OP9 per 0 Giornata di co-coltura. Vedi Figura 4b. Piastra mStrawberry OP9 cellule a 1x10 ⁴ / cm ² per confluenza il giorno 0. Assicurati di sottocultura cellule extra per giorno Giorno 5 e 8 / 9 per la prosecuzione del co-coltura.
3. ES / mStrawberry OP9 co-coltura Set-Up (giorno 0)
   1. Lavare le cellule ES 2 volte con PBS
   2. Trypsinize cellule ES con pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA, incubare per 5 min @ 37 ° C
   3. Aggiungi Co-cultura mediatica differenziazione di cellule
   4. Pellet di cellule staminali a 400xg, 5-7min, RT. Gettare il surnatante
   5. Risospendere le cellule in co-cultura mediatica differenziazione
   6. Rimuovere i supporti da mStrawberry OP9 cellule
   7. Aggiungi Co-cultura mediatica differenziazione mStrawberry fiaschi OP9
   8. Piastra 1x10 ³ celle ES / cm ² a fiasco di mStrawberry OP9 cellule. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO ₂ con l'umidità.
4. mStrawberry OP9 cellule (Giorno 2)
   1. MStrawberry sottocultura OP9 in modo da avere strati confluenti di cellule mStrawberry OP9 per il giorno 5 di co-coltura. Piastra mStrawberry OP9 cellule a 1x10 ⁴ / cm ² per confluenza in occasione della Giornata 5 (come al punto 3.2). Assicurati di sottocultura celle supplementari per il giorno 8 / 9, se necessario (come al punto 2.2).
5. ES / mStrawberry OP9 co-coltura (Giorno 3)
   1. Rimuovere con attenzione medio di co-coltura e sostituire con nuovi co-cultura medio differenziazione

6. ES / mStrawberry OP9 co-coltura (giorno 5)

   1. Lavare accuratamente co-colture 2x con PBS
   2. Trypsinize cellule con pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA
   3. Lavare le cellule off pallone con co-cultura mediatica differenziazione
   4. Celle a pellet 400xg, 7min, RT. Gettare il surnatante
   5. Aggiungi Co-cultura mediatica differenziazione di cellule. Utilizzare una 21-gauge bluntended per risospendere le cellule e per garantire la sospensione singola cella
   6. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Dovrebbe avere 100-150 volte maggiore del numero di cellule ES da giorno 0.
   7. Re-seme 6.48x10 ⁴ / cm ² - 7.76x10 ⁴ / cm ² co-coltura le cellule su un nuovo livello di confluenti, mStrawberry OP9 cellule
   8. Giorno 5 TEST-rimanente co-coltura le cellule possono essere utilizzate per l'analisi di citometria a flusso, cytopreps (30K celle), le analisi ChIP, ecc
7. ES / mStrawberry OP9 co-coltura (giorno 8 / 9 e Giorno 12)
   1. Rimuovere i supporti di differenziazione dal pallone e salvare. Lavare monostrato 1x con PBS per rimuovere le cellule ematopoietiche in sospensione. Non gettare le cellule ematopoietiche.
   2. Trypsinize cellule aderenti con pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA
   3. Lavare le cellule off pallone con i media differenziazione ES e aggiungere alle cellule ematopoietiche si trovano in sospensione =
   4. Celle a pellet 400xg, 7min, RT. Gettare il surnatante
   5. Aggiungi Co-cultura differenziazione dei media o PBS alle cellule. Utilizzare una 21-gauge bluntended per risospendere le cellule e di assicurare per le singole cellule delle cellule sospensione Conte utilizzando un emocitometro.
   6. Co-coltura può essere continuato per 14 giorni per valutare progenitori emopoietici più maturo da risemina co-coltura le cellule su un nuovo livello di confluenti, mStrawberry OP9 cellule in occasione della Giornata 8 o 9 e poi di nuovo il giorno 12. Re-seed numero di cellulare ottimizzato basato sul recupero delle cellule necessarie per giorno di test.
8. Valutazione della ES-derivati ​​progenie (giorno 1-14). ES-derivati ​​progenie possono essere valutate in qualsiasi giorno della co-coltura di flusso smistamento mStrawberry cellule negative (ES-derivati ​​progenie).
   1. Rimuovere i supporti di differenziazione dal pallone e salvare. Lavare monostrato 1x con PBS per rimuovere le cellule ematopoietiche in sospensione. Non gettare le cellule ematopoietiche.
   2. Trypsinize cellule aderenti con pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA
   3. Lavare le cellule off pallone con co-cultura mediatica differenziazione e aggiungere alle cellule ematopoietiche si trovano in sospensione
   4. Celle a pellet 400xg, 7min, RT. Gettare il surnatante
   5. Risospendere le cellule con 21-gauge bluntended e contare
   6. Progenie ES-derivati ​​(mStrawberry cellule negative) possono essere ordinati dal flusso positivo mStrawberry OP9 cellule. Progenie ES-derivati ​​possono essere caratterizzati con l'analisi in citometria a flusso, cytopreps, analisi ChIP, ecc

4. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. ES / mStrawberry OP9 co-cultura di sistema. Il nostro laboratorio utilizza un cellulare in vitro in ES co-coltura di sistema per lo sviluppo del modello ematopoietiche. In questo sistema di co-coltura, le cellule ES differentiate, in emangioblasti al 5 ° giorno, quando si trova su uno strato confluente di mStrawberry OP9 cellule. Come co-coltura procede, precursori ematopoietici sono presenti 8 ° giorno, mentre terminalmente differenziate linee ematopoietiche appaiono di giorno 14. Le frecce indicano i giorni di differenziazione quando passaging di ES-derivati ​​progenie sui nuovi strati confluenti di mStrawberry OP9 cellule necessarie.

Figura 2. Una corretta differenziazione delle cellule ES. Le cellule staminali sono seminate su uno strato confluente di mStrawberry OP9 il giorno 0. ES-derivati ​​progenie cominciano a diventare visibili a 3 ° giorno di differenziazione, con ES-derivati ​​progenie che sembra un ammasso di cellule con un bordo definito o iniziando a formare un modello spirale. Emangioblasti, che sono i precursori comuni mesoderma per i lignaggi endoteliali e ematopoietiche, dovrebbe apparire come ammucchiate spirali di cellule al 5 ° giorno. Per la co-coltura periodi superiori a cinque giorni, ES-derivati ​​progenie dovrebbe apparire come ammassi di cellule ematopoietiche. Da due a quattro gruppi monocellulari, in occasione della Giornata 6 / 7, dovrebbe comparire e crescere in gruppi di cellule più grandi entro il giorno 8 / 9 della co-coltura. Progenie ES altri derivati ​​si trovano anche strettamente legata allo strato aderente cellule stromali.

Figura 3. Infruttuoso differenziazione delle cellule ES. I risultati di questa co-coltura riflettere improprio differenziazione delle cellule ES. Si noti come l'ES-derivati ​​progenie non appaiono in un modello a spirale 5 ° giorno. L'assenza di cellule in un modello spirale indica la formazione impropria hemangioblast. Se hemangioblast non si sviluppano correttamente, poi continuò co-coltura si tradurrà in stentato differenziazione lignaggio ematopoietiche. Co-culture con formazione hemangioblast improprio devono essere eliminati.

Figura 4. mStrawberry OP9 colture cellulari. (A) mStrawberry cellula OP9 sono subcoltura a70-90% confluenza. (B) Per la differenziazione corretta, le cellule ES e ES-derivati ​​progenie sono posti su uno strato troppo confluenti di mStrawberry OP9 cellule.

Figura 5. Rappresentante ES / mStrawberry OP9 Co-cultura profilo di flusso. Tutti ES-derivati ​​progenie sono mStrawberry cellule negative e possono essere ordinati dal flusso mStrawberry OP9 cellule. mStrawberry porta cellulare negativa è stata determinata utilizzando un tradizionale ES/OP9 co-coltura.

Discussione

Corretta differenziazione delle cellule ES sullo strato confluenti di cellule mStrawberry OP9 risultati nella produzione di Flk1 emangioblasti + al 5 ° giorno di co-coltura. Emangioblasti dovrebbe apparire come ammucchiate spirali di cellule, come osservato in Figura 1. Per il resto della co-coltura, visibile ES-derivati ​​progenie dovrebbe apparire come ammassi di cellule ematopoietiche (Figura 1). Al 6 ° giorno / 7 03:58 ammassi cellulari dovrebbe comparire e crescere in cluster cella più grande (sia aderenti e in sospensione) entro il giorno 8 / 9 della co-coltura. Progenie ES altri derivati ​​si trovano anche strettamente legati all'interno dello strato aderente cellule stromali.

Anche se non elencati nel protocollo, è fondamentale pre-test del FBS utilizzare nel supporto della crescita ES, la mStrawberry OP9 terreni di coltura e la ES / mStrawberry OP9 mezzi differenziazione. Adeguatamente testati siero dovrebbe garantire la corretta crescita di mStrawberry OP9 cellule, così come, proprio la differenziazione delle cellule ES in co-coltura fino a 5 ° giorno di differenziazione. In alternativa o in aggiunta al mStrawberry OP9 cellule, OP9 cellule possono essere irradiati, a 8000 rad, prima della semina a confluenza (7.8x10 ⁴ celle / cm ^2). Irradiazione di cellule OP9 permette l'eliminazione delle ripetute fasi replating, nonché, permette l'eliminazione quasi totale della vecchia, contaminando OP9 cellule di test a valle.

OP9 cellule sono state progettate per esprimere la proteina mStrawberry di trasduzione OP9 cellule con 3ug/mL di un mStrawberry vettori lentivirali che esprimono sotto il controllo di un promotore CMV (pRRLsin-CMV vettore, UCLA vettore core).

Standard ES/OP9 co-coltura protocolli comportano il collocamento di cellule staminali embrionali su un confluenti strato OP9 cellule, così come, a 5 passo replating giorno per ridurre vecchio, contaminando OP9 cellule dal passaggio delle cellule. Inoltre, solo le cellule ematopoietiche si trovano in sospensione vengono rimossi per la valutazione di ES-derivati ​​progenie. Tuttavia, sia con un passo replating e la raccolta di cellule in sospensione una sola manca potenzialmente un numero considerevole di sviluppo ES-derivato cellule ematopoietiche. Questo problema diventa importante affrontare quando si cerca di caratterizzare i difetti ematopoietiche associati a linee ES eliminazione diretta. Per aggirare questo problema il nostro laboratorio utilizzato una versione modificata di co-cultura, attraverso l'utilizzo di mStrawberry che esprimono OP9 cellule. Questo assicura che tutte le progenie ES sono trasferite al continuo co-cultura al giorno 5, e per la raccolta di tutte le ES-derivati ​​progenie per saggi a valle. Questa modifica fornisce strumenti utili nella valutazione e caratterizzazione di progenie ematopoietiche derivate da entrambe le ES umane e delle linee del mouse.

Questo ES-mStrawberry OP9 co-coltura modello ricapitola le varie fasi primitive e ematopoiesi definitiva. Nello studiare le prime fasi di sviluppo ematopoietici, molte persone utilizzano la batteria BL-CFC (Blast-come cellule formanti colonie) test, che valutano lo sviluppo del hemangioblast dalle cellule staminali. Mentre il modello BL-CFC saggio è uno strumento utile nell'ambito delle indagini primi stadi dello sviluppo ematopoietico, il mStrawberry-ES co-coltura sistemi mostre utilità aumentare in quanto consente per la valutazione delle hemangioblast, così come, linee ematopoietiche più adulto.

Il lavoro precedente con OP9/ES tradizionali e protocolli differenziazione EB ha dimostrato che altri fattori forse necessario, come l'iperespressione di HoxB4, al fine di ricavare lungo termine ripopolare le cellule staminali ematopoietiche in vitro. Lavoro supplementare è necessario valutare se mStrawberry negativo, in ordine ES-derivati ​​popolazioni contengono vere cellule staminali ematopoietiche.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
aMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Omega scientifico	FB01	Pre-Tested
L-glutammina	Cellgro	25-005-CI	200nm
Tripsina-EDTA	Stem Cell Technologies	07901

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
aMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Hyclone	SH30070	Pre-Tested
L-glutammina	Cellgro	25-005-CI	200mm
PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +)	Cellgro	21-031-CV
Tripsina-EDTA	Stem Cell Technologies	07901