Измененный ES / OP9 сотрудничеству культуры протокола обеспечивает повышенную характеристика гемопоэтических Потомство

Резюме

mStrawberry OP9 клетки позволяют всесторонней оценки всех ES полученных потомством от совместного культуры.

Аннотация

В пробирке дифференциации ЭС клеток по отношению к судьбе гемопоэтических ячейки полезна при изучении клеточных популяций, которые трудно получить доступ в естественных условиях и для характеристики ранних генов, участвующих в кроветворении, без необходимости иметь дело с эмбриональными lethalities. ES/OP9 совместно культуры система изначально была разработана для получения кроветворных потомства, не над производством макрофагов, как OP9 стромальных клеточной линии происходит от черепа из остеопетроз мутантных мышей, которые не имеют функциональных M-CSF. В пробирке ES/OP9 совместно культуры система может быть использована для того, чтобы резюмировать ранних гемопоэтических развития. При культивировании на OP9 стромальные клетки, стволовые клетки дифференцируются в Flk-1 + hemangioblasts, кроветворной предков, и, наконец, зрелые, терминально дифференцированные линий. Стандартный ES/OP9 совместно культуры протокол предусматривает размещение ЭС клеток на сливной слой OP9 клеток; а также, периодические replating шаги, чтобы удалить старые, загрязняя OP9 клеток. Кроме того, текущие протоколы включают оценку только гемопоэтические клетки, находящиеся во взвешенном состоянии и не оптимизированы для оценки ЭС полученных потомством на каждый день дифференциации. Однако, с replating шаги и уборки только клетки, подвески могут оказаться одной из пропускает большую часть ES полученных потомством и развитие кроветворных клеток. Этот вопрос приобретает важное значение для решения при попытке охарактеризовать гемопоэтических дефектов, связанных с линиями нокаутом ES. Здесь мы опишем изменение ES / mStrawberry OP9 со-культуры, которая позволяет по ликвидации загрязнения OP9 клетки вниз по течению анализов. Этот метод позволяет всесторонней оценки всех ES полученных потомством на все дни со-культуры, в результате чего гемопоэтических картина дифференциации, которые более непосредственно соответствует гемопоэтических картина дифференциации наблюдается в зародыше.

протокол

1. Подготовка ЭС клеток

1. Культура ЭС клеток в соответствии со стандартом протокола для вашего конкретного клеточной линии. Убедитесь в том, чтобы подготовить достаточное количество клеток ES к пластине на о mStrawberry OP9 клетки на День 0 (ЭС клетки будут покрыты на 1x10 ^ 3 клеток на см ² в День 0)

2. Подготовка OP9 клетки

1. Перед растущей mStrawberry OP9 клеток, подготовить OP9 питательной среды
   ОП-9 культуре клеток среднего
   

   	Акции	Заключительные конц.	Объем (мл)
   aMEM			39,5
   FBS (ОП-9 испытания)	100%	20%	10
   L-глютамин	100X (200 мм)	2 мМ	0,5
   			50 мл

   
   Хранить при температуре 4 ° C и употребить в течение одной недели с момента подготовки
2. В целях поддержания mStrawberry OP9 клетки, СМИ необходимо менять каждые 2 дня и клетки должны быть субкультивировали до достижения слияния клетки (субкультуры на 70-90% слияния). mStrawberry OP9 клеточных культурах, никогда не вышла за пределы 90% слияния, поскольку это приведет к их дифференцировке в адипоциты. См. рисунок 3.
   1. Субкультура клеток мытье клетки 2X с PBS (или 1x с PBS + 1x 0,1% с Трипсин-EDTA)
   2. Добавить подогретого 0,1% трипсина-EDTA при 37 ° С в течение 5 минут (или до клетки отделяются)
   3. Когда клетки имеют индивидуальный добавить ОП-9 ростовой среды. Передача клетки 50 мл коническую трубку.
   4. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре. Discard супернатант.
   5. Ресуспендируют клеток в свежей mStrawberry OP9 питательной среды
   6. Пластина клеток при минимальной плотностью 10 ^{4 клеток} / см ²
   7. Расти mStrawberry OP9 клетки до слияния, начиная за 3 дня до дня необходимо для совместного культивирования ЭС клетки (День 0, 5-й день, или Day8 / 9 от эксперимента)

3. ES / mStrawberry OP9 сотрудничеству культуры

1. Подготовка сотрудничества медиакультуры дифференциации
   

   	Акции	Окончательный	Объем (мл)
   aMEM			39,5
   FBS	100%	20%	10
   L-глютамин	200 мМ	2 мМ	0,5
   			50 мл

2. mStrawberry OP9 клетки (День -3)
   1. ВСЕГДА Субкультура OP9 клетки с Днем -3, так что у вас есть сливной слоев mStrawberry OP9 клеток для День 0 совместного культуры. См. рисунок 4б. Пластина mStrawberry OP9 клеток 1x10 ⁴ / см ² для слияния в день 0. Убедитесь, что субкультура дополнительные клетки для 5-й день и День 8 / 9 для продолжения совместной культуры.
3. ES / mStrawberry OP9 совместно культуры Set-Up (день 0)
   1. Вымойте ЭС клетки 2x с PBS
   2. Trypsinize ЭС клетки с подогретого 0,25% трипсина-EDTA, инкубировать 5 мин @ 37 ° C
   3. Добавить сотрудничества медиакультуры дифференциации в клетки
   4. Гранул ЭС клеток в 400xg, 5-7мин, РТ. Удалите надосадочную
   5. Ресуспендируют клеток в сотрудничестве медиакультуры дифференциации
   6. Удаление информации из mStrawberry OP9 клетки
   7. Добавить сотрудничества медиакультуры дифференциации mStrawberry OP9 колбах
   8. Пластина 1х10 ³ ЭС клеток / см ² до колбу mStrawberry OP9 клеток. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% СО ₂ с влажностью.
4. mStrawberry OP9 клеток (день 2)
   1. Субкультура mStrawberry OP9 так что у вас есть сливной слоев mStrawberry OP9 клеток для 5-й день со-культуры. Пластина mStrawberry OP9 клеток 1x10 ⁴ / см ² для слияния в День 5 (как в пункте 3.2). Убедитесь, что субкультура дополнительные клетки для Дня 8 / 9, в случае необходимости (как в пункте 2.2).
5. ES / mStrawberry OP9 совместно культуры (День 3)
   1. Осторожно снимите среды от совместного культуры и заменить свежей сотрудничества культуре дифференциация среды

6. ES / mStrawberry OP9 совместно культуры (День 5)

   1. Тщательно промойте совместно культур 2x с PBS
   2. Trypsinize клеток с подогретого 0,25% трипсина-EDTA
   3. Вымойте клетки от колбы с сопредседателями медиакультуры дифференциации
   4. Гранул клеток 400xg, 7мин, РТ. Удалите надосадочную
   5. Добавить сотрудничества медиакультуры дифференциации клеток. Используйте 21 калибра bluntended иглы для ресуспендирования клеток и обеспечить для суспензии отдельных клеток
   6. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Должен был 100-150 кратное увеличение числа клеток ES с первого дня 0.
   7. Re семян 6.48x10 ⁴ / см ² - 7.76x10 ⁴ / см ² со-культуре клеток на новый слой вырожденных, mStrawberry OP9 клетки
   8. День 5-анализов Оставшиеся совместно культуре клетки могут быть использованы для проточной цитометрии анализа, cytopreps (30K клеток), ChIP анализы и т.д.
7. ES / mStrawberry OP9 совместно культуры (День 8 / 9 и 12 день)
   1. Удалить дифференциации средств массовой информации из колбы и сохранить. Вымойте монослоя 1x с PBS для удаления гемопоэтических клеток в суспензии. Не выбрасывать гемопоэтических клеток.
   2. Trypsinize прилипшие клетки с подогретого 0,25% трипсина-EDTA
   3. Вымойте клетки от колбу со средствами массовой информации ES дифференциации и добавить в кроветворной клетки, находящиеся во взвешенном состоянии =
   4. Гранул клеток 400xg, 7мин, РТ. Удалите надосадочную
   5. Добавить сотрудничеству культуры дифференциации средств массовой информации или PBS к клеткам. Используйте 21 калибра bluntended иглы для ресуспендирования клеток и обеспечить для одной клеточной суспензии клеток с использованием графа гемоцитометра.
   6. Сотрудничество культуры может быть продолжено в течение 14 дней для оценки более зрелых гемопоэтических предшественников путем повторного посева совместно культуре клеток на новый слой вырожденных, mStrawberry OP9 клеток в День 8 или 9, а затем снова на 12 день. Re семян оптимизированы количество клеток основана на необходимости восстановления ячейки день анализа.
8. Оценка ES полученные потомства (День 1-14). ES-производные потомства может быть оценена в любой день совместной культуре с помощью проточной разобраться mStrawberry негативные клетки (ES-производные потомства).
   1. Удалить дифференциации средств массовой информации из колбы и сохранить. Вымойте монослоя 1x с PBS для удаления гемопоэтических клеток в суспензии. Не выбрасывать гемопоэтических клеток.
   2. Trypsinize прилипшие клетки с подогретого 0,25% трипсина-EDTA
   3. Вымойте клетки от колбы с сопредседателями медиакультуры дифференциации и добавить в кроветворной клетки, находящиеся во взвешенном состоянии
   4. Гранул клеток 400xg, 7мин, РТ. Удалите надосадочную
   5. Ресуспендируют клеток с 21 калибра bluntended иглы и считать
   6. ES-производные потомство (mStrawberry негативные клетки) могут быть отсортированы от потока mStrawberry положительные OP9 клеток. ES-производные потомства могут быть охарактеризованы с помощью проточной цитометрии анализа, cytopreps, ChIP анализы и т.д.

4. Представитель Результаты:

Рисунок 1. ES / mStrawberry OP9 сотрудничеству региональные параметры системы. Наша лаборатория использует в пробирке ЭСК совместно культуре системы для моделирования гемопоэтических развития. В этой совместной системе культуры, ES клетки дифференцируются, в hemangioblasts на Day5, когда они размещены на сливной слой mStrawberry OP9 клеток. Как со-культуры продолжается, кроветворные предшественники присутствуют на 8-й день, в то время терминально дифференцированные гемопоэтических линий появляются на 14-й день. Стрелки указывают дней дифференциации, когда пассажи ES полученных потомством на новые вырожденные слои mStrawberry OP9 клеток необходимо.

Рисунок 2. Правильное дифференциации клеток ES. ЭС клетки высевают на сливной слой mStrawberry OP9 в день 0. ES-производные потомства начинают становятся видимыми на 3-й день дифференциации, с ES-производные потомства похожий скопление клеток с определенной границы или начинает формироваться оборота узор. Hemangioblasts, которые являются общими мезодермального предшественником эндотелиальных и гемопоэтических линий, должны появиться как свалили мутовках клеток в 5-й день. Для совместной культуры срок более пяти дней, ES-производные потомство должно появиться в виде кластеров гемопоэтических клеток. От двух до четырех одноклеточных кластеров, в День 6 / 7, должны появиться и развиваться в более крупные кластеры ячейки День 8 / 9 от со-культуры. Другие ES производные потомство находятся также тесно связан с приверженцем стромального слоя клеток.

Рисунок 3. Неудачный дифференциации клеток ES. Результаты этого сотрудничества культуры отражают неправильное дифференциации клеток ES. Обратите внимание, как Е. С. полученных потомством не появляются в обороте картины на 5-й день. Отсутствие клеток в обороте картины указывает неправильное формирование hemangioblast. Если hemangioblast не развивается должным образом, то продолжение сотрудничества культуры приведет к задержке гемопоэтических дифференциации происхождения. Сотрудничество культурах с ненадлежащим формирование hemangioblast должен быть уничтожен.

Рисунок 4. mStrawberry OP9 клеточных культурах. () mStrawberry OP9 ячейки субкультивируют на70-90% слияния. (B) Для правильной дифференциации ЭС клетки и ES-производные потомства помещаются на чрезмерно сливной слой mStrawberry OP9 клеток.

Рисунок 5. Представитель ES / mStrawberry OP9 сотрудничеству культуры профиля потока. ES Все полученные потомства mStrawberry негативные клетки и могут быть отсортированы от потока mStrawberry OP9 клеток. mStrawberry отрицательный строб ячейки определяли с помощью традиционных ES/OP9 со-культуры.

Обсуждение

Правильное дифференцировку ЭС клеток на сливной слой mStrawberry OP9 клеток приводит к производству Flk1 hemangioblasts + на 5-й день со-культуры. Hemangioblasts должен выглядеть свалили мутовках клеток, как это наблюдалось на рисунке 1. В течение оставшейся части со-культуре, видимыми ES-производные потомство должно появиться в виде кластеров гемопоэтических клеток (рис. 1). На Day6 / 7 3:58 кластеры клетка должна появиться и развиваться в более крупные ячейки кластеров (как приверженец и в виде суспензии) на День 8 / 9 от со-культуры. Другие ES производные потомство находятся также тесно связаны в приверженцем стромального слоя клеток.

Хотя это и не перечислены в протоколе, он имеет решающее значение для предварительного тестирования FBS используется в среде ES роста, mStrawberry OP9 питательной среды и ES / mStrawberry OP9 СМИ дифференциации. Правильно испытания сыворотки должны обеспечить должный рост mStrawberry OP9 клеток, а также, в надлежащих дифференцировку ЭС клеток в со-культуры до 5 день дифференциации. В качестве альтернативы или в дополнение к mStrawberry OP9 клеток, OP9 клетки могут быть облученные, в 8000 рад, до посева на слияния (7.8x10 ^{4 клеток} / см ^2). Облучение OP9 клетки позволяет устранение повторяющихся replating шагов, а также, позволяет почти полная ликвидация старых, загрязняющих OP9 клетки вниз по течению анализов.

OP9 клетки были спроектированы, чтобы выразить mStrawberry белка трансдуцирующих OP9 клеток с 3ug/mL из лентивирусов вектор выражения mStrawberry под контролем промотора CMV (pRRLsin-CMV вектор, вектор UCLA ядро).

Стандартный ES/OP9 совместно культуры протоколов повлечь за собой размещение ЭС клеток на сливной слой OP9 клеток, а также, в 5-й день replating шаг, чтобы уменьшить старые, загрязняя OP9 клетки из ячейки проход. Кроме того, только гемопоэтические клетки, находящиеся во взвешенном состоянии удаляются для оценки ЭС полученных потомством. Тем не менее, как с replating шаг и уборки только клетки, подвески могут оказаться одной из пропускает значительное число развивающихся ES-производные гемопоэтических клеток. Этот вопрос приобретает важное значение для решения при попытке охарактеризовать гемопоэтических дефектов, связанных с линиями нокаутом ES. Для того чтобы обойти этот вопрос нашей лаборатории использовали модифицированный совместно культуры, за счет использования mStrawberry экспрессирующих OP9 клеток. Это гарантирует, что все ES потомству передаются на продолжение сотрудничества культуры в 5-й день, а для урожая всех ES полученных потомством для последующих анализов. Эта модификация обеспечивает полезными инструментами оценки и характеристика гемопоэтических потомства основе как человеческие, так и линии мыши ES.

Это ES-mStrawberry OP9 совместно культуры модель повторяет различных стадиях примитивным и окончательное кроветворения. При изучении ранних этапов развития кроветворной, многие люди используют BL-CFC (Blast-подобные колониеобразующих клеток) анализа, которые позволяют оценить развитие hemangioblast из ЭСК. Хотя BL-CFC анализ является полезным инструментом при исследовании ранних гемопоэтических развития, mStrawberry-ES совместно культуры системах экспонатов увеличения утилиты, так как позволяет для оценки hemangioblast, а также, более взрослый гемопоэтических линий.

Предыдущая работа с использованием традиционных OP9/ES и протоколов EB дифференциации показывает, что дополнительными факторами, может быть необходимо, например, гиперэкспрессия HoxB4 для того, чтобы получить долгосрочную заселения гемопоэтических стволовых клеток в пробирке. Дополнительные работы необходимо оценить, насколько mStrawberry отрицательным, отсортированных ES полученных населением содержат истинные гемопоэтических стволовых клеток.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
aMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Омега Научные	FB01	Предварительное тестирование
L-глютамин	Cellgro	25-005-ДИ	200 нм
Трипсин-EDTA	Stem Cell Технологии	07901

Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
aMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Hyclone	SH30070	Предварительное тестирование
L-глютамин	Cellgro	25-005-ДИ	200 мМ
PBS (без Са 2 + и Mg 2 +)	Cellgro	21-031-CV
Трипсин-EDTA	Stem Cell Технологии	07901