Modification ES / OP9 co-culture protocole prévoit caractérisation améliorée de Progeny hématopoïétiques

Résumé

mStrawberry OP9 cellules de permettre une évaluation complète de tous les descendants issus de ES-co-culture.

Résumé

La différenciation in vitro des cellules ES vers un destin de cellules hématopoïétiques est utile lorsque l'on étudie les populations de cellules qui sont difficiles d'accès in vivo et pour caractériser les premiers gènes impliqués dans l'hématopoïèse, sans avoir à traiter avec lethalities embryonnaire. La co-culture ES/OP9 système a été initialement conçu pour produire une descendance hématopoïétiques, sans la production au cours des macrophages, comme la ligne OP9 cellules stromales est dérivé de la calvaria de souris mutantes qui manquent ostéopétrose fonctionnelle M-CSF. In vitro, la co-culture ES/OP9 système peut être utilisé afin de récapituler le développement précoce hématopoïétiques. Lorsqu'elle est cultivée sur cellules stromales OP9, les cellules ES se différencient en Flk-1 + hémangioblastes, les progéniteurs hématopoïétiques, et enfin mature, en phase terminale lignées différenciées. La norme ES/OP9 protocole de co-culture implique le placement de cellules ES sur une couche confluente de cellules OP9, ainsi que, périodiquement étapes replating afin d'enlever les vieux, contaminant OP9 cellules. Par ailleurs, les protocoles actuels consistent à évaluer uniquement les cellules hématopoïétiques trouve en suspension et ne sont pas optimisés pour l'évaluation des ES dérivées progéniture à chaque jour de la différenciation. Cependant, avec des étapes replating et la récolte des cellules en suspension que l'on manque potentiellement une grande partie des ES dérivées de la descendance et le développement de cellules hématopoïétiques. Cette question devient importante pour répondre lorsque vous essayez de caractériser les défauts hématopoïétiques associés aux lignes ES KO. Nous décrivons ici une modification ES / mStrawberry OP9 co-culture, qui permet l'élimination des cellules contaminantes OP9 à partir d'essais en aval. Cette méthode permet à l'évaluation complète de tous les descendants ES dérivées à tous les jours de co-culture, résultant en un modèle de différenciation hématopoïétique, qui concernent plus directement le modèle correspond à la différenciation hématopoïétique observées au sein de l'embryon.

Protocole

1. Préparation des cellules ES

1. Les cellules ES culture selon le protocole standard pour votre lignée cellulaire donnée. Assurez-vous de préparer des cellules ES assez pour plaque sur les cellules OP9 mStrawberry pour la Journée 0 (cellules ES seront plaquées à 1x10 ^ 3 cellules par cm ² au jour 0)

2. Préparation des cellules OP9

1. Avant croissante mStrawberry OP9 cellules, préparer le milieu de croissance OP9
   OP-9 milieu de culture cellulaire
   

   	Stock	Conc final.	Volume (ml)
   AMEM			39,5
   FBS (OP-9 testés)	100%	20%	10
   L-glutamine	100X (200mm)	2mM	0.5
   			50mL

   
   Conserver à 4 ° C et utiliser dans une semaine de préparation
2. Afin de maintenir mStrawberry OP9 cellules, les médias doivent être changés tous les 2 jours et les cellules doivent être repiquées avant d'atteindre les cellules de confluence (subculture à 70-90% de confluence). cultures de cellules OP9 mStrawberry sont jamais grandi au delà de 90% de confluence comme cela se traduira dans leur différenciation en adipocytes. Voir Figure 3.
   1. Repiquer les cellules par des cellules à laver avec du PBS 2X (ou 1x avec PBS 1x + 0,1% à la trypsine-EDTA)
   2. Ajouter préchauffé 0,1% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 minutes (ou jusqu'à ce que les cellules se détacher)
   3. Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter moyennes OP-9 de la croissance. Transfert des cellules dans un tube de 50 ml conique.
   4. Pellet cellules à 300 xg pendant 5 minutes à température ambiante. Rejeter le surnageant.
   5. Resuspendre les cellules dans l'eau douce mStrawberry OP9 milieux de croissance
   6. Cellules de la plaque à une densité minimale de 10 ⁴ cellules / cm ²
   7. Cultivez mStrawberry OP9 cellules à confluence commençant 3 jours avant le jour nécessaire pour les cellules ES co-culture (jours 0, 5, ou Jour8 / 9 de l'expérience)

3. ES / mStrawberry OP9 co-culture

1. Préparez le support de différenciation co-culture
   

   	Stock	Finale	Volume (ml)
   AMEM			39,5
   FBS	100%	20%	10
   L-glutamine	200 mM	2mM	0.5
   			50mL

2. mStrawberry OP9 cellules (Jour -3)
   1. TOUJOURS Subculture OP9 cellules -3 jours, alors que vous avez couches confluentes de cellules OP9 mStrawberry pour 0 Jour de la co-culture. Voir la figure 4b. Plaque mStrawberry OP9 cellules à 1x10 ⁴ / cm ² pour confluence au jour 0. Soyez sûr de sous-culture des cellules supplémentaires pour Jour 5 et Jour 8 / 9 pour la poursuite de la co-culture.
3. ES / mStrawberry OP9 co-culture Set-Up (jour 0)
   1. Laver les cellules ES 2x avec du PBS
   2. Trypsiniser cellules ES avec préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA, incuber pendant 5min à 37 ° C
   3. Ajouter le média de différenciation co-culture de cellules
   4. Pellet cellules ES à 400xg, 5-7min, RT. Rejeter le surnageant
   5. Resuspendre les cellules dans les médias de différenciation co-culture
   6. Retirez le support du mStrawberry OP9 cellules
   7. Ajouter le média de différenciation co-culture à mStrawberry flacons OP9
   8. Plaque 1x10 cellules ES ³ / cm ² à flacon de mStrawberry OP9 cellules. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ avec l'humidité.
4. mStrawberry OP9 cellules (Jour 2)
   1. OP9 mStrawberry Subculture de sorte que vous avez des couches confluentes de cellules pour mStrawberry OP9 Jour 5 de la co-culture. Plaque mStrawberry OP9 cellules à 1x10 ⁴ / cm ² pour confluence au Jour 5 (comme dans l'étape 3.2). Soyez sûr de sous-culture des cellules supplémentaires pour la Journée 8 / 9, si nécessaire (comme dans l'étape 2.2).
5. ES / mStrawberry OP9 co-culture (Jour 3)
   1. Retirez délicatement moyennes à partir de co-culture avec des produits frais et de remplacer milieu de différenciation co-culture

6. ES / mStrawberry OP9 co-culture (Jour 5)

   1. Se laver soigneusement les co-cultures 2x avec du PBS
   2. Trypsiniser cellules avec préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA
   3. Laver les cellules hors flacon avec les médias de différenciation co-culture
   4. Cellules Pellet au 400xg, 7min, RT. Rejeter le surnageant
   5. Ajouter le média de différenciation co-culture de cellules. Utiliser une aiguille de calibre 21 bluntended pour resuspendre les cellules et d'assurer la suspension seule cellule
   6. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Devrait avoir 100 à 150 fois plus en nombre de cellules ES du jour 0.
   7. Réensemencez 6.48x10 ⁴ / cm ² - 7.76x10 ⁴ / cm ² de co-culture de cellules sur une nouvelle couche de confluence, les cellules OP9 mStrawberry
   8. Jour 5 ESSAIS-restant co-culture des cellules peuvent être utilisées pour l'analyse de cytométrie en flux, cytopreps (30K cellules), des dosages à puce, etc
7. ES / mStrawberry OP9 co-culture (Jour 8 / 9 et la Journée 12)
   1. Retirez le support de différenciation du ballon et sauver. Lavez monocouche 1x avec du PBS pour éliminer les cellules hématopoïétiques en suspension. Ne jetez pas sur les cellules hématopoïétiques.
   2. Trypsiniser cellules adhérentes avec préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA
   3. Laver les cellules hors flacon avec les médias de différenciation ES et ajouter à cellules hématopoïétiques trouve en suspension =
   4. Cellules Pellet au 400xg, 7min, RT. Rejeter le surnageant
   5. Ajouter une différenciation co-culture des médias ou du PBS aux cellules. Utiliser une aiguille de calibre 21 bluntended pour resuspendre les cellules et d'assurer pour les cellules de cellule unique Comte de suspension à l'aide d'un hémocytomètre.
   6. Co-culture peut être poursuivi pendant 14 jours afin d'évaluer plus mature progéniteurs hématopoïétiques par des re-semis de co-culture de cellules sur une nouvelle couche de confluence, les cellules OP9 mStrawberry au Jour 8 ou 9 puis à nouveau le jour 12. Réensemencez nombre de cellules optimisé basé sur la récupération des cellules nécessaires pour le jour de dosage.
8. Évaluation des ES dérivées descendance (Jour 1-14). ES dérivées de la descendance peut être évaluée sur n'importe quel jour de la co-culture par un écoulement tri mStrawberry cellules négatives (ES dérivées de descendance).
   1. Retirez le support de différenciation du ballon et sauver. Lavez monocouche 1x avec du PBS pour éliminer les cellules hématopoïétiques en suspension. Ne jetez pas sur les cellules hématopoïétiques.
   2. Trypsiniser cellules adhérentes avec préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA
   3. Laver les cellules hors flacon avec les médias de différenciation co-culture et l'ajouter aux cellules hématopoïétiques trouve en suspension
   4. Cellules Pellet au 400xg, 7min, RT. Rejeter le surnageant
   5. Resuspendre les cellules avec 21 aiguille de calibre bluntended et compter
   6. Descendances ES dérivées (mStrawberry cellules négatives) peuvent être triés du flux positifs mStrawberry OP9 cellules. Descendances ES dérivées peuvent alors être caractérisé par une analyse de cytométrie en flux, cytopreps, des dosages à puce, etc

4. Les résultats représentatifs:

Figure 1. ES / mStrawberry OP9 co-culture du système. Notre laboratoire utilise une étude in vitro de cellules ES de co-culture du système au modèle de développement hématopoïétique. Dans ce système de co-culture, les cellules ES de différencier, dans hémangioblastes au Jour 5, lorsqu'il est placé sur une couche confluente de cellules mStrawberry OP9. Comme le produit de co-culture, précurseurs hématopoïétiques sont présents au Jour 8, tandis terminale différenciée lignées hématopoïétiques apparaissent au jour 14. Les flèches indiquent jours de différenciation lors du repiquage ES dérivées de la descendance sur de nouvelles couches confluentes de cellules dans mStrawberry OP9 nécessaire.

Figure 2. Une bonne différenciation des cellules ES. Les cellules ES sont ensemencées sur une couche confluente de mStrawberry OP9 au jour 0. ES dérivées de la descendance commence à devenir visible au jour 3 de la différenciation, avec l'ES-dérivée progéniture ressemble à un amas de cellules avec une frontière définie ou début pour former un motif verticille. Hémangioblastes, qui sont le précurseur commun mésodermiques pour les lignées endothéliales et hématopoïétiques, doit apparaître comme entassés verticilles de cellules au Jour 5. Pour la co-culture de plus longues périodes de cinq jours, ES dérivées de la descendance doit apparaître comme des amas de cellules hématopoïétiques. Deux à quatre pôles unicellulaires, au Jour 6 / 7, doit apparaître et se développer en des amas de cellules plus grandes par jour 8 / 9 de la co-culture. Descendances ES Autres dérivés sont également trouvés étroitement liée à la couche de cellules stromales adhérentes.

Figure 3. Échec de différenciation des cellules ES. Les résultats de cette co-culture reflètent mauvaise différenciation des cellules ES. Notez comment la descendance ES dérivées n'apparaissent pas dans un schéma verticille au Jour 5. L'absence de cellules dans un modèle verticille indique la formation hémangioblaste incorrecte. Si hémangioblaste ne se développe pas correctement, puis a continué de co-culture se traduira dans la différenciation hématopoïétique lignée rabougris. Co-cultures avec la formation hémangioblaste incorrecte doit être jeté.

Figure 4. cultures cellulaires mStrawberry OP9. (A) mStrawberry OP9 cellules sont repiquées à70-90% de confluence. (B) Pour une différenciation appropriée, les cellules ES et ES dérivées descendance sont placés sur une couche excessivement confluent de mStrawberry OP9 cellules.

Figure 5. Représentant ES / mStrawberry profil OP9 flux de co-culture. Toute la descendance ES dérivées de cellules négatives sont mStrawberry et peuvent être triées à partir du flux de OP9 mStrawberry cellules. mStrawberry porte de cellule négative a été déterminée en utilisant un ES/OP9 traditionnelle de co-culture.

Discussion

Une différenciation adéquate des cellules ES sur couche confluente de cellules OP9 mStrawberry résultats dans la production de FLK1 hémangioblastes + au jour 5 de la co-culture. Hémangioblastes doit apparaître comme entassés verticilles de cellules, comme observé dans la figure 1. Pour le reste de la co-culture, visible ES dérivées de la descendance doit apparaître comme des amas de cellules hématopoïétiques (figure 1). Au Jour6 / 7 de deux à quatre groupes de cellules doit apparaître et se développer en des amas de cellules plus grandes (deux adhérentes et en suspension) par jour 8 / 9 de la co-culture. Descendances ES Autres dérivés sont également trouvés étroitement liés dans la couche de cellules stromales adhérentes.

Bien que ne figurant pas dans le protocole, il est essentiel de pré-test du FBS utilisée dans le milieu de croissance ES, le OP9 mStrawberry milieux de croissance et de l'OP9 ES / mStrawberry médias différenciation. Correctement testé le sérum doit assurer une bonne croissance des cellules mStrawberry OP9, ainsi que la différenciation correcte des cellules ES en co-culture jusqu'au 5ème jour de la différenciation. Comme alternative ou en complément de mStrawberry OP9 cellules, les cellules OP9 peut être irradié, à 8000 rads, avant de semer à confluence (7.8x10 ⁴ cellules / cm ^2). L'irradiation des cellules OP9 permet l'élimination des étapes répétées replating, ainsi que, permet d'éliminer presque complète des anciens, contaminant OP9 cellules à partir d'essais en aval.

OP9 cellules ont été conçues pour exprimer la protéine de transduction par mStrawberry OP9 cellules avec 3ug/mL d'un vecteur lentiviral mStrawberry exprimer sous le contrôle d'un promoteur CMV (CMV pRRLsin-vecteur, vecteur de l'UCLA de base).

Standard ES/OP9 co-culture protocoles impliquent la mise en place des cellules ES sur une couche confluente OP9 cellules, ainsi que, une étape replating jour 5, afin de réduire ancienne, contaminant OP9 cellules de passage cellulaire. En outre, seuls les cellules hématopoïétiques trouve en suspension sont éliminées pour l'évaluation des ES dérivées de la descendance. Cependant, à la fois avec une étape replating et la récolte des cellules en suspension que l'on manque potentiellement un nombre substantiel de l'élaboration ES dérivées de cellules hématopoïétiques. Cette question devient importante pour répondre lorsque vous essayez de caractériser les défauts hématopoïétiques associés aux lignes ES KO. Afin de contourner ce problème notre laboratoire a utilisé une modification de co-culture, à travers l'utilisation de mStrawberry exprimant OP9 cellules. Ceci assure que toute la descendance ES sont transférés à la poursuite de co-culture au jour 5, et pour la récolte de toute la descendance ES dérivées pour les dosages en aval. Cette modification prévoit une outils utiles dans l'évaluation et la caractérisation des descendances hématopoïétiques provenant à la fois humaines et des lignées ES de souris.

Cette OP9 ES-mStrawberry récapitule modèle de co-culture des différentes étapes primitives et l'hématopoïèse définitive. En étudiant les premières étapes du développement hématopoïétique, de nombreuses personnes utilisent le BL-CFC (Blast-comme des cellules formant colonie) de dosage, qui évaluent le développement de l'hémangioblaste des cellules ES. Alors que le test BL-CFC est un outil utile lors des enquêtes début de développement hématopoïétique, le mStrawberry-ES systèmes de co-culture des expositions d'utilité augmenter car elle permet de l'évaluation de l'hémangioblaste, ainsi que, plus adulte lignées hématopoïétiques.

Des travaux antérieurs utilisant OP9/ES traditionnelle et des protocoles de différenciation EB a montré que des facteurs supplémentaires peut être nécessaire, comme la surexpression de HOXB4, afin d'en tirer à long terme repeupler les cellules souches hématopoïétiques in vitro. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour évaluer si mStrawberry négatif, triés ES dérivées de populations contiennent vraie cellules souches hématopoïétiques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif	Société	Nombre de catalogue	Commentaires
AMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Omega scientifique	FB01	Pré-testés
L-glutamine	Cellgro	25 à 005-CI	200nm
Trypsine-EDTA	Stem Cell Technologies	07901

Nom de réactif	Société	Nombre de catalogue	Commentaires
AMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Hyclone	SH30070	Pré-testés
L-glutamine	Cellgro	25 à 005-CI	200 mM
PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +)	Cellgro	21 à 031-CV
Trypsine-EDTA	Stem Cell Technologies	07901