ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

要約

この記事では、ネガティブ染色電子顕微鏡（EM）を用いて生体高分子の三次元（3D）再構成を得るために標準的な方法を説明します。このプロトコルでは、我々はランダムな円錐形の傾斜の再構成法（RCT）を使用して中解像度でサッカロマイセスセレビシエエキソソーム複合体の立体構造を取得する方法について説明します。

要約

単粒子の電子顕微鏡（EM）の復興は、最近大きな高分子複合体の3次元（3D）構造を得るためによく使われる道具となっている。 X線結晶構造解析と比較すると、それはいくつかのユニークな利点があります。最初に、単一粒子EM再建は特に大きな高分子複合体のために、X線結晶構造解析のボトルネックであるタンパク質試料を、結晶化する必要はありません。第二に、タンパク質サンプルを大量に必要としません。結晶化に必要なタンパク質のミリグラムと比較して、単一の粒子EMの再建はネガティブ染色EM法を用いて、ナノモル濃度のタンパク質溶液のいくつかのマイクロリットルを必要とします。しかし、高い対称性を持ついくつかの高分子アセンブリにもかかわらず、単一の粒子は、EMは、特にそれらの対称性のない多くの標本については（1より小さいナノメートルの分解能）、比較的低解像度で制限されています。このテクニックはまた、研究対象の分子の大きさによって制限され、一般的に凍結水和した試料のためのネガティブ染色標本と300 kDaのための、すなわち約100 kDa。

未知構造の新たなサンプルの場合、我々は一般的に否定的染色によって分子を埋め込むために重金属のソリューションを使用してください。試料は、分子の2次元（2D）の顕微鏡写真を取るために透過型電子顕微鏡で検査されます。理想的には、タンパク質分子が均一な3次元構造を持っていますが、顕微鏡写真で、異なる方向を示す。これらの顕微鏡写真は、"単粒子"としてデジタル化し、コンピュータで処理されます。二次元アライメントと分類の技術を使用して、同じビュー内の均一な分子は、クラスにクラスタ化されています。彼らの平均は、分子の2D形状の信号を強化する。我々は適切な相対的な方向（オイラー角）を持つ粒子を割り当てた後、我々は、3D仮想ボリュームに2次元粒子画像を再構成することができるようになります。

単粒子三次元再構築では、本質的なステップは、正しく各単粒子の正しい方向を割り当てることです。角度再構成¹とランダムな円錐形のチルト（RCT）方法²を含め、各粒子のビューを割り当てるには、いくつかの方法があります。このプロトコルでは、我々は否定的染色EMとRCTを用いた酵母エキソソーム複合体の三次元再構成を得ることに私たちの実践を説明します。それは電子顕微鏡と画像処理の我々のプロトコルは、RCTの基本原理を次のように、メソッドを実行する唯一の方法でないことに注意してください。まず、連続的な薄いカーボン膜の層で覆われた穴あきカーボングリッドを使用して、タンパク質の大きさに匹敵する厚さを持つウラニルギの層にタンパク質試料を埋め込む方法について説明します。その後、試料を収集するための透過型電子顕微鏡に挿入されますuntilted（0度）と処理すると酵母のエクソソームの初期3Dモデルを得るために後で使用される顕微鏡の傾斜（55度）のペア。この目的のために、我々は、RCTを実行して、洗練された方法^3と一致した投影を使用して初期3Dモデルをリファイン。

プロトコル

1。ランダムコニカルチルト方式の原理

1. ランダムな円錐形の傾斜法の原理は、電子顕微鏡内の試料の同じ領域の顕微鏡写真のペアを取る必要があります。一枚の写真はuntilted位置で試料から取得されます（図1A）と他の画像を50〜70度（私たちのケースでは、我々は55度を使用）との間の角度で傾斜した試料から取得されます。 （図1B）
2. 選択されているコンピュータを使用して、デジタル化された顕微鏡写真のペアが同一の粒子からの側と画像を並べて置かれる。 （図1C）
3. 三次元座標で、untilted粒子およびその傾斜のパートナーの画像は、傾斜軸の方向と傾斜角度によってお互いに対比される。 （図1D）
4. untilted粒子画像の位置合わせは、対応する方位角の位置に傾いた粒子の画像をもたらします。 （図1E）
5. 方位空間を充填傾いた粒子の複数の画像を用いて、分子の三次元構造は、逆投影アルゴリズムを使用して再構成することができる。 （図1F）
   
   図1。RCT再建のための原理の説明図。

2。薄い炭素で被覆されたホーリーカーボンのグリッドを準備

理由：私たちは、ラン​​ダムな円錐形の傾斜の再建のためにタンパク質サンプルを修正するために、負染色法を使用する。あまりにも乾燥中にフラット化することなく高分子を保持するために、我々は蛋白質⁴の次元についての厚さと深い染色でタンパク質分子を埋め込 ​​むようにしてください。一般的には、連続炭素は、ネガティブ染色標本を作る際に使用されています。炭素のような種類は、しかし、蛋白質の粒子の周り汚れ厚さを制御することは困難である。そこで我々は、ネガティブ染色標本を作るために炭素膜の薄層（〜5 nmの厚さ）で覆われたホームメイドの穴あきカーボングリッドを使用してください。穴によって形成される小さな井戸は、それが最適な染色厚さのタンパク質を埋め込むことがはるかに簡単であるので、グリッド上でタンパク質溶液や染色液を保持することができます。また、穴の上にカーボンの薄い層が大幅にバックグラウンドノイズを低減します。

1. 0.5％Formvarの溶液を調製します。ドラフトでは、100mLのガラスビーカーに0.45グラムのポリビニルホルマール樹脂、90 mLのクロロホルムを加える。ビーカーをカバーするためにアルミ箔を使用し、マグネチックスターラーで正式な樹脂を溶解するための小型の攪拌棒を使用。それは樹脂を溶かすために約15分かかります。
2. Formvarの解散時に、メタノールできれいな顕微鏡のスライドガラスとキムワイプで拭いて乾かしてください。
3. Formvar樹脂が完全にクロロホルムに溶解された後、溶液の表面に1 mLの50％グリセロールを追加。追加されたグリセリンの量を調整すると、穴あき炭素の穴の密度に影響を与えます。約1インチの深さでの溶液中ultrasonicatorの先端を浸してFormvarソリューションにおけるグリセロールの液滴のエマルジョンを作るために1分を超音波処理する最大電力を使​​用してください。解決策は、このステップの後乳白色になります。もはや超音波処理は、穴あき炭素の穴の小さいサイズになります。
4. すぐに超音波処理した後、、1秒エマルジョンに垂直に洗浄したガラススライドを浸漬して取り出し、そしてスライドの表面上に薄いプラスチックのフィルムを形成するためにろ紙を用いてスライド"底を覆い隠す。クロロホルムが蒸発した後、光学顕微鏡下でフィルムの穴の密度とサイズを確認してください。ニーズに応じて作製条件を調整します。条件ここで説明すると、我々は一般に3〜4マイクロメートル、400メッシュグリッドの各正方形で10〜20の穴の直径で穴を得る。
5. ガラスのスライドが乾燥したら、スライド面上にプラスチックフィルムの端をカット。蒸留水の表面にフィルムを浮かべます。水の表面に薄膜を光反射に対する視射角で観察することができます。フィルム面を下にグリッド"滑らかな表面を持つ一つずつ、上に置いて400メッシュの銅グリッド。
6. 一枚の紙を使用して、その上にグリッドを有するプラスチックフィルムを拾う。紙を反転し、ペトリ皿に乾燥させます。穴の残留グリセロールを除去し、空気中の紙は、乾燥させ、メタノールで紙を浸す。
7. 炭素の蒸発器で〜20ナノメートルの厚さと炭素の層でコーティンググリッドを。厚さは、炭素の灰色の色によって決定することができる。
8. Formvarを削除するには、半時間のためのクロロホルム中の炭素とグリッドを浸す。グリッドを乾燥された後、我々は、自家製ホーリーカーボングリッドを得ている。
9. 新鮮な劈開マイカの表面に厚さ約5ナノメートルと炭素の薄い層を蒸発させる。
10. 慎重に蒸留水の下に穴あきカーボングリッドを置く。水の表面に雲母表面から薄いカーボンをフロートし、穴あきカーボン上に堆積しゆっくりとグリッド。ドラフト内でグリッドを乾かします。

3。エキソソーム複合体の負染色

論拠：酢酸ウラニル、ウラニルギ、リンタングステン酸、モリブデン酸アンモニウム、およびその他を含むネガティブ染色EM、のために使用することができるかなりの数の重金属染色解決方法があります。別の染色液は異なるユニークな特性を持っています。例えば、酢酸ウラニルは、粒子の高コントラストを提供しますが、酸性の環境が好きではないタンパク質複合体をクラッシュする可能性があります。これらのサンプルの場合は、中性pHでphosphotungestic酸が良い染色液かもしれません。我々は、その細かい粒度および分子への高い浸透能力に起因する飽和ウラニルギ（UF）ソリューションを選択してください。

1. 1分間蒸留水を沸騰させます。室温にゆっくりとそれを冷やす。このステップでは、水から溶存酸素を除去することです。
2. 新鮮な2％ウラニルギ（UF）ソリューションとなります。 1.5 mlチューブに1 mLの水と20 mgのUFを混ぜる。 10分間ボルテックス。
3. 10 Mの水酸化カリウムの2マイクロリットルを添加することにより5.0にpH値を調整します。すぐに混ぜる。溶液の色がより黄色になります。溶液のpHが高すぎるすべきではない、そうでなければ汚れが沈殿。
4. 別の10分間ボルテックスにチューブを置く。
5. 10分間、最高速度でデスクトップ遠心上でソリューションを回転させる。
6. 0.2マイクロメーターのPVDF膜を介してソリューションをフィルタリングする。これは、新鮮なUFソリューションです。光を防ぐためにアルミ箔の部分での解のチューブをカバーする。解決策は、同じ日に使用する必要があります。
7. グロー放電つの電流25ミリアンペアで30秒間、グロー放電装置を用いた薄カーボンオーバーホーリーカーボングリッド。
8. ベンチにきれいなパラフィルムの断片を入れてください。パラフィルムの上に50マイクロリットルのUF染色液の3滴を入れてください。
9. 希釈バッファー（25mMトリス - 塩酸pH7.5、100mMのNaCl、2mMのDTT）を用いて50〜100 nMの濃度にエキソソーム複合体を希釈する。グロー放電グリッド上の希釈タンパク質の4マイクロリットルを入れてください。サンプルは、1分間のグリッドに滞在しましょう​​。 （注：分子のこのような最終濃度は、一般的にネガティブ染色格子上の粒子をよく分散の最適な濃度を与えるウラニルギまたはウラニルacecate染色液は、一般の塩のリン酸塩または高濃度（0.5 M）は。良好な染色結果を得るには適していません。私たちの経験ヘペスまたはパイプがウラニル染色ソリューションでうまく動作することを示唆している。）
10. グリッドの端から残液をブロットおよび染色液滴の上にすぐにグリッドを反転し、各液滴で、約10秒間のグリッドを洗浄するためにろ紙片を使用してください。
11. 最後のすすぎの後、別の1分間グリッドの汚れ滞在を聞かせて後、ろ紙片で離れて染色汚点。良い深い染色結果を得るためにグリッドの表面上に染色液の薄層をキープ。グリッドは、ドラフト内で急速に乾燥させます。

4。エキソソーム複合体の電子顕微鏡

理論的根拠：傾斜ステージを持つ任意の透過型電子顕微鏡がRCT再建のための試料の傾きのペアを収集するために使用することができます。理論的には、より高い角度標本は、より良いデータを収集するために傾斜させることができる。実際には、試料ホルダーとグリッドの形状の設計が原因で、最大操作可能な角度は50〜70度から制限されています。このプロトコルでは、我々は唯一のFEI Tecnai - 12電子顕微鏡を使って私たちの手順を説明します。顕微鏡の他のモデルの場合、操作は楽器のプロジェクトとプロパティの要件に応じて調整する必要があります。

1. サンプルホルダーにサンプルのグリッドを配置し、FEI Tecnai -12電子顕微鏡にホルダーを置く。顕微鏡は120 kVで運営されています。我々は写真を撮るためにガタンUltrascan4000 CCDカメラを使用してください。デジタル顕微鏡写真のインタフェースの"コンフィギュレーションカメラ"ダイアログで"垂直軸周りの反転は、"正しい利き手の決定を確保するためにチェックされていないことを確認してください。 （注：これは読者が3次元モデルを得るためにSPIDER RCT再建手続きに依存している場合は特に重要です）
2. 最高のステンド正方形を見つけるために、低倍率でのサンプルのグリッドを確認してください。正方形のような種類は、それらの約1〜2マイクロメートルと暗い汚れの領域の寸法と穴のダースが必要です。 （図2）
   
   図2。善と悪の汚れで正方形を示すグリッドの低倍率の顕微鏡写真。
3. FEIのユーザインタフェースの低線量モードをオンにして、検索を合わせ、焦点と低線量モードにおける位置を公開します。我々は、露出と検索のための回折で1.5メートルのカメラの長さのために、焦点のために52000を15万倍を使用してください。露光時間は1秒に調整されます。離れて露出POSからフォーカス位置2マイクロメータを設定します。傾斜軸に沿ってition。
4. 検索モードで良好な染色で穴を見つけ、そして場所を保存してください。良いホールは、一般的に、それらの暗い染み勾配は、検索モードで観察している。正方形のCCDの写真を撮る。 、55度に試料を傾けての撮影。二つの絵を比較し、二つの顕微鏡写真でペア穴を確認。 （図3）
   
   図3。サーチモードでの正方形の顕微鏡写真の傾きのペア。対応する対の穴が示されている。
5. 0度に戻っ​​てステージを傾けて。高倍率での検索モードで特定された各ホールの写真を撮るために低用量のキットを使用する。使用されるデフォーカスは、約-0.7ミクロンである。
6. すべての穴があるのは写真を撮影された後、55度にステージを傾ける。 -1.2約1μmのデフォーカスとuntiltedものと同じ倍率で傾斜試料の顕微鏡写真を取る。低倍率の顕微鏡写真のパターンに基づいて、顕微鏡写真の対応する傾斜ペアを識別します。自家製ホーリーカーボングリッドの不規則なパターンは、相関をすることができます。顕微鏡写真の傾きペアを調べ、そのような浅いステンドエリア（粒子が傾いた状態で、それらの周りにハローを持っているように見える）などの悪い汚れと顕微鏡写真を削除してください。 （図4）
   
   図4高倍率での試料の顕微鏡写真の二つの傾きのペア。良い面と悪い面顕微鏡写真をマークされています。

5。データの画像処理

理論的根拠：コンピュータのRCTの再建を行うためにさまざまなオプションとソフトウェアパッケージがあります。最も一般的に使用されるSPIDER ⁵です。 SPIDERのRCTを実施するための基本的なプロトコルは、ウェブページで見つけることができますhttp://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html 。 SPIDERのRCTを実行するための詳細なプロトコルがShaikhさんらの論文に記載されている^。6は我々のプロトコルでは、我々はIMAGIC - ⁵の組み合わせとプロトコルのビデオ版でSPIDERを使用してください。我々はまた、単にプロトコルのテキストバージョンでSPIDERを使用する代替手順を提供しています。

1. プログラムをセットアップします。我々は、ガタンデジタル画像からSPIDERの画像形式に画像形式を変更するEMAN ⁸パッケージでproc2dを使用。 IMAGIC - 5は、2D位置合わせを行うために使用されます。 SPIDERは、3次元再構成し、改良を行うために使用されます。

サブセクション1：粒子の傾きのペアを選ぶ。

2. EMANのproc2dコマンドを使用して、SPIDERの画像形式に*. DM3ガタンデジタル画像に変換します。傾いたとuntiltedのペアはそれぞれ、*** t.spiと*** u.spiとしてパターンに名前が付けられています。
3. SPIDERプログラムパッケージで配布'WEB'プログラムを使用して粒子のペアを選択してください。の命令に従ってください座標が自動にそれぞれuntiltedと傾いた粒子にDCU ***. SPIとDCT ***. SPIに保存されます。別のドキュメントDCB ***. SPIが傾いたとuntilted粒子間の傾き角度の情報が含まれています（注：。シータが持っていないため、傾きのペアの間にWEBでのフィッティング中に3つの角度が、最終的な再建の正しい利き手を保証するものではありません符号（正の値）とφとγは、それらに設定された初期値に依存しています。傾いた顕微鏡写真にデフォーカス勾配の方向を調べると正しいを取得するために、フィッティングの前にφとγの正しい初期値を設定するに役立つだろう再建。図5の利き手は、正しい規則を示しています。）
   
   図5。デフォーカス勾配によって決定されたフィッティングモードを選ぶWEBチルトペア粒子の角度決定の規則を説明する図。 Lは低デフォーカスエリアを表し、Hは高デフォーカス領域を表します。矢印は傾斜軸を表します。 PHIとGAMM​​Aに対応する正しい初期角度は、それぞれのスキームのために示されている。
4. ウェブページに示すようにSPIDERのスクリプトの修正版を使用してすべての厳選された粒子はそのままhttp://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/partpick.htmlを 。スクリプトはu.spiとt.spiとしてuntiltedと傾いた粒子のスタックを保存します。粒子からなる顕微鏡写真の番号がparticle_list.spiに保存する必要があります。 （注：これはために適切なオイラー角のファイルを生成するための非常に重要です。RCT。）

サブセクション2：二次元アライメントとuntilted粒子画像の分類。

5. untilted粒子はImagic - 5パッケージでem2emのプログラムを使用してIMAGIC - 5形式に変換します。整列と反復IMAGIC - 5プログラム（付録A）を使用して均質なクラスに粒子を分類する。クラスは私達がimagic_classes.lisとして保存粒子、のルックアップテーブルを生成するためにIMAGIC - 5のMSA -名前でクラスコマンドを使用する。 （注：各クラスの分類とアライメントは同じ形状の粒子の数を増やすだけでなく、クラス内のばらつきを低減するためである分散マップは、クラスの品質に関する情報を提供することができます。）
6. IMAGIC - 5でheaderコマンドを使用して、各粒子の位置合わせの移動と回転の値のプロットファイル（ビデオデモンストレーションでali_50.plt）を生成します。
7. SPIDER文書ファイルbase_file ***. SPIにクラスのルックアップテーブルに分散perlスクリプトのlis2spi.pl使用して変換するhttp://cryoem.berkeley.eduを 。
8. で配布スクリプトのplt2spi.pl使用SPIDERの文書ファイルのali_50.spiにステップ5.6の変換と回転の値に対して生成されるプロットのファイルから各粒子の位置合わせの移動と回転の値に変換http://cryoem.berkeley.eduを 。
   それは我々の手にこの仕事で最高のパフォーマンスを得られるので、我々は2D位置合わせと分類のためIMAGIC - 5を使用してください。二次元アライメントと分類のためのSPIDERの代替戦略はで見つけることができますhttp://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html 。我々はまた、エクソソームのuntilted粒子の2次元解析を行うためにSPIDERを使用している。以下は簡単な手順です。
   で説明したように代替5.5）を参照のない整列を使用して、画像の位置を合わせます。つの簡単なスクリプトを見つけることができます。文書ファイルのangular_file.spi内のすべてのパーティクルの回転とシフトを保存します。
   代替5.6）で説明したように同じビューを持つグループに整列粒子の分類私たちは、分類のためのK - means法を用いている。分類に基づいてbase_file ***. SPIを生成します。

サブセクション3：傾斜粒子画像を用いた三次元再構築。

9. バンドパスフィルタ、マスクとセンターだけIMAGIC - 5のuntilted粒子のような傾いた粒子。というタイトルの粒子のための新しいデータセットを生成します。 （注：この手順は省略可能ですがそれはSPIDERで行うことができます。）
10. クラスのルックアップテーブルのドキュメントali_50.spi、ステップ5.3および付録BのようにSPIDERのスクリプトを使用して、ステップ5.4からの粒子のリストファイルのpartile_list.spiのウェブによって生成されたDCB ***. spiのファイルからanglular文書ファイルを作成します。
11. で説明したように各クラスの再建を行うためにSPIDERで復興のスクリプトを使用してhttp://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html 。粒子のすべてのクラスは一つの3次元再構成のボリュームに貢献しています。 3Dモデルは、UCSF -キメラ⁹で調べることができます。オイラー角（0,0,0）で、3Dモデルの二次元投影は、再建の品質を検証するためにuntilted粒子から対応する2Dクラスの平均と比較することができます。同様のボリュームを見つけ、手順の以下の初期ボリュームを生成するために、それらを合わせて、マージhttp://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html 。

サブセクション4：untilted粒子画像を用いた三次元再構成の改良。

12. 高解像度のvolumを取得するために、すべてのuntilted粒子に対して結合された最初のボリュームの投影に一致する改良を行うで説明されているようにSPIDERのスクリプトを使用して欠落しているコーンや平坦化アーティファクトのない電子http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/recon/refine.html 。

6。代表的な結果：

RCTの方法を使用して、我々は5,000チルトペア（図6）の合計からエクソソームの約50再建を取得している。 50 3次元モデルから、我々は主に二つの直交ビューでグリッド上で複雑な座っての異なる方向を見ることができます。平坦化アーティファクトは、炭素表面に垂直な方向のボリュームの多くでも検出可能です。我々は、アライメントを行い、直交ビューで2つの初期ボリュームを生成する3次元ボリュームのマージ。 5000 untilted粒子画像を使用して、我々は両方の初期モデル（図7）から約18オングストロームの解像度でエクソソームの同じ最後の3次元再構成を取得している。構造は、酵母のエクソソームのアーキテクチャを明らかにし、RNA基質供給経路¹⁰に洞察を提供した。

図6。RCT再建によりエクソソーム複雑な50 3Dモデル。

図7。改良後のエキソソーム複合体の三次元再構成。

付録：

IMAGIC - 5の2D位置合わせと分類のための付録Aには、スクリプトファイル。
ファイル：auto_align_i.sh
ファイルはこちら

付録B. SPIDERの3次元再構成のための角度のファイルを生成するためのスクリプトファイル。
ファイル：generate_angular_file.spi
ファイルはこちら

ディスカッション

この記事では、サンプル調製の詳細なプロトコルと否定的染色の電子顕微鏡を使用してエキソソーム複合体の三次元再構成を提示する。この方法を使用して、我々は構造の任意の予備知識がなくてもランダム円錐形の傾斜法を用いて三次元再構成を得る。ランダムな円錐形の傾斜法では必ずしも均質なサンプルを必要としませんが、以下の投影に一致する精製ステップでは、高分解能を達成?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyvinyl Formal Resin	Electron Microscopy Sciences	63450-15-7
Uranyl Formate	Electron Microscopy Sciences	22451
Superfrost Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific, Inc.	4951F-001
400 mesh grid regular	SPI Supplies	3040C
Carbon coater Auto 306	Edwards Lifesciences
Tecnai-12 Electron Microscope	FEI
Glow Discharger	BAL-TEC		Sputter Coater SCD 005