口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

要約

標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。

要約

局所領域頭頸部癌の浸潤、転移のリスクにリンクされ、患者管理戦略の設計および実装の困難な課題を提示しています。口腔癌の同所性マウスモデルは、インパクトの侵略その要因の研究を促進し、抗腫瘍治療薬を評価するためのモデルシステムとして開発されている。これらのシステムでは、口腔組織内播種性腫瘍細胞の可視化では、通常、従来の組織型によってまたは in vivo生物発光の方法でと行われてきた。これらの技術の主な欠点は、正確に三次元でのプライマリサイトに起因する初期の腫瘍細胞の浸潤を可視化し定量化するための固有のできないことです。ここでは、舌腫瘍の広がりのマルチベクトル可視化を可能にするために二光子イメージングと舌の扁平上皮癌（SCOT）のための確立されたモデルを組み合わせたプロトコルについて説明します。 OSC - 19頭頸部腫瘍細胞株は安定的にmCherry蛍光タンパク質（LifeAct - mCherry）に融合した、F -アクチン結合ペプチドのLifeActを発現するように設計されました。これらの細胞を注入Fox1 ^{nu / nu}マウスでは、確実に舌が二光子顕微鏡の生体外のアプリケーションによって可視化するための腫瘍を形成。この手法は、腫瘍塊の同所性可視化を可能にし、局所的に地域の腫瘍の微小環境を中断することなく、切除された舌の細胞に侵入。さらに、このシステムは、原発腫瘍部位から細胞の移動を侵略した距離を計算することにより腫瘍細胞の浸潤の定量化が可能になります。全体的にこの手順では、SCOTの浸潤や局所浸潤や遠隔転移拡散を防止するために合わせた治療的処置に寄与する要因を分析するための拡張されたモデルのシステムを提供します。また、このメソッドは、最終的にin vivoでの設定での他の画像診断法と組み合わせることが可能性を秘めています。

プロトコル

1。細胞株、ベクターの構築およびレンチウイルス生産

1. 人間の頭頸部の腫瘍細胞株は、（OSC19またはUMSCC1）10％ウシ胎児血清FBS（Hycloneの猫＃SH30070.03）、1％ペニシリンを添加した（Cellgroの猫＃50 - 003 - PB）DMEMから成る、完全な培地で培養された/ストレプトマイシン（Cellgroの猫＃30 - 002 - CI）、および1％非必須アミノ酸（Cellgroの猫＃25 - 025 - CI）。
2. pLL7.0レンチウイルスベクターにLifeAct - mCherryコード配列を転送するには、cDNAの親mCherryでSbf1認識部位は、部位特異的突然変異誘発（ストラタジーン社製の猫＃200518〜5）を使用して、認識配列に3つのサイレント変異を導入することによって変更されました。その結果修正されたLifeAct - mCherryのシーケンスは、PCRはEcoR1/Sbf1サイトに隣接して増幅し、pLL7.0 - LifeAct - mCherry構築を生成するためにpLL7.0にサブクローニングした。

2。 pLL7.0 - LifeAct - mCherryのウイルス産生

1. ウイルス産生は、レンチウイルス発現システムマニュアル（システムバイオサイエンスバージョン2から051018）に基づいて行われました。
2. パッケージング細胞株293T/17細胞（ATCCカタログ番号CRL - 11268）HNSCC線に使用したのと同じ完全培地中40％コンフルエンスまで増殖させた。
3. 細胞はそれぞれ（クロンテックの猫＃631312）CalPhosを使用して、pLL7.0 - LifeAct - mCherry、psPAX2、そして3時02分01秒の比率でpVSV - Gベクターをトランスフェクションした。
4. 24時間後、トランスフェクションからの最初のメディアは、新鮮な培地に交換した。
5. メディアは、その後回収と補充、12時間ごとに72時間、4℃で保存した

3。安定LifeAct - mCherry発現と頭頚部の細胞株の産生

1. 収集されたメディアは、4℃で10分間2000rpmで回転させた℃で
2. ウイルスを含む明らかにメディアの一mlを直接12時間OSC19またはUMSCC1細胞に添加した。次いで、細胞をリンスした、とウイルスの追加の1枚のMLは、別の12時間内の追加されました。
3. 細胞は耐性コロニーを選択するために2週間200mg/mlピューロマイシンを含む培地で処理した。
4. 生き残ったクローンは、蛍光顕微鏡でLifeAct - mCherry発現のために視覚的にスクリーニングした。個々の陽性コロニーを滅菌した3ミリメートルクローニングディスク（フィッシャーの猫＃0790710A）を使用してtypsinizedした。
5. 陽性細胞は、バック凍結または同所性注入に使用するまで200mg/mlピューロマイシンを含む培地で維持した。

4。同所性腫瘍異種移植片の形成

1. すべての動物の手順は、ウェストバージニア大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコール（09〜0821）に準拠して実施された。
2. LifeAct - mCherry発現する腫瘍細胞は、トリプシン処理、遠心分離し、2.5 × 10 ^4個の細胞を50μL完全培地に再懸濁したれた。
3. 腫瘍細胞は27 ½ゲージの注射針に接続された1ミリリットルの注射器に充填した。
4. 女性の無胸腺Fox1 ^{nu / nu}マウス8週齢（ハーランラボラトリーズは）ケタミン及び10mg/kgより少ないキシラジンを80mg/kgの組み合わせで麻酔した。麻酔したマウスは、加温パッドに37〜40 ° Cの間で維持された。
5. 滅菌ピンセットを用いて、舌の先端を穏やかに把握し、慎重に口腔内から引き出された。
6. 細胞は徐々に舌動脈を避けて、舌の中心部に球根状の塊を作成するために、各舌の片側に注入した。
7. マウスは、2.1mg/kgのヨヒンビンを注入し、それらが麻酔からの回復中に2〜3時間のために監視されたヒーティングパッドに戻された。
8. 一度復活、マウスはソフトトランスジェニック生地の食（Bioserveの猫＃S3472）を含む滅菌ケージに入れた。
9. マウスは2〜3日ごとに秤量して、腫瘍の発症のために視覚的にモニターした。

5。 生体外イメージングのためのマウスの舌の準備

1. 異なる時点（通常は2週間から4週間後の注射）で腫瘍を保有するマウスは、二酸化炭素の吸入によって安楽死させた。
2. 舌は、抽出1X PBSでリンスし、地元のホビーショップやサイズ8縫針からモノフィラメント糸を使用して、従来のパラフィン組織包埋カセットの片側（StatLab猫＃H104、）に添付された。
3. 舌が固定化された後は、全体のカセットのアセンブリは、30ミリメートル組織培養皿に置かれ、1X PBSで浸漬した。
4. 処理された舌はすぐに2光子励起顕微鏡を使用した。

6。二光子顕微鏡による舌腫瘍のイメージング

1. 舌のカセットは正立顕微鏡（;サターインスツルメンツ可動顕微鏡（MOM））の目的の下に配置引き込み式のカンチレバーアーム（商工会議所シャトル、シスキユー楽器）にカスタム設計されたホルダーに固定1X PBSを含む60ミリメートル皿に浸漬した。
2. 40X/0.8NAの水浸対物レンズを直接目に見えるタム上または覆うように配置されたまたは病変。サファイアレーザー（ミラ、コヒーレント）60 MWを755 nmの入力波長での強度mCherry信号を最適化する：舌は、Tiとの二光子顕微鏡で画像化した。
3. シリアル1ミリメートルのレーザースキャン画像は、15と100μm（腫瘍体積に応じて）の間の総組織の深さ以上1μmの増分の深さで採取された。画像はscanimage、カレルヴォ研究所（Janeliaファーム、HHMI）が開発したMATLABのプラットフォームをベースとしたオープンソースのプログラムを使用して捕獲された。 scanimageでもは、x / yガルバノスキャンミラーを制御するためにラスタスキャンパターンの2チャンネルの出力を生成し、同時に（PCI - 6610Sのデータ収集ボードを介して光電子増倍管（光電子増倍管）から同時に最大4チャンネルの信号の入力をキャプチャ、ナショナルインスツルメンツ）。 PMTの信号はモニター画面に表示するためにNI - DAQボードに供給する前に、低ノイズ電流のプリアンプ（SR570、スタンフォードリサーチシステム）により増幅される。 scanimageでも、客観的のz軸を制御することにより、Zスタック画像を収集し、単一またはサイクルモードでのタイムラプス画像を収集します。画像は16ビットの深さを持つ単一のTIFFファイルに保存されていました。

7。アミラのソフトウェアを使用して、画像解析

1. 腫瘍定量のためのアミライメージング：Aimraのソフトウェアでは、Zスタック画像のセットを含むTIFFファイルを開きます。
2. ファイル名を強調表示し、三次元レンダリングを生成するためにVoltex機能を選択して適用。総称して浸潤細胞のいくつかの小さな、解離侵襲グループ（IG）を持つ大規模な原発腫瘍の画像は、レンダリングされた画像（図6Aを参照）で典型的に明らかである。
3. 原発腫瘍の塊を選択し、次に"ラベルフィールド"、"ラベル"、"オープンデータ"を選択します。
4. 主な閾値すべてのZスタック画像を腫瘍には、選択して三次元の中で唯一の原発腫瘍塊を含めることを確保するためにz -平面の画像をスクロールします。これは通常、フィールドの最大サイズの画像であり、画像化されたが、z -平面を介して走査されたときに、多くの場合、セグメント化されます。
5. 腫瘍信号のいずれかをバックグラウンド蛍光を修正し、破棄することなく、画像からそれを排除するために魔法の杖/しきい値関数を使用してください。 "内部ファイル"のラベルをハイライトし、⊕のボタンをクリックします。 "すべてのスライス"のチェックボックスを選択します。これは、すべてのZスタックインクリメントの閾値原発腫瘍領域の周囲に色付きの境界線を生成します。
6. IGSを選択するには、"新しい"機能を選択してください。単一のIGを選択して、z平面のスクロールでは、原発腫瘍に関連付けられていないことを確認してください。
7. "すべてのスライス"を選択し、⊕のボタンをクリックします。ファイル（：IG 1 EX）の名前を変更
8. 7.4閾値処理手続きと決定IG 7.5のハイライト手順を繰り返します。原発腫瘍の塊を示すために使用される色とは異なる輪郭の色を選択します。
9. IGSが示されているすべてを確実にするためにz -平面をスキャン、画像全体の各追加IGのため、必要に応じて手順を繰り返します。画像上で将来の識別で特定された各IGエイズのために異なる色を使用した。
10. 原発腫瘍と、すべてのIGSを選択したら、プルダウンメニューから"セグメンテーション"を選択し、"素材の統計"を選択します。これは、ボリュームの測定だけでなく、X、YとXの腫瘍の中心は、腫瘍の点から、IGSの距離を計算するために、原発腫瘍の座標を提供します。
11. 計算されたボリュームで、原発腫瘍の中央のコアから各IGの距離を決定する。その後、"セグメンテーション"、"マテリアルの統計"を選択してください。このステップでは、ピクセルにすべての測定値を計算します。顕微鏡対物と倍率の任意の追加増加（;ズーム機能すなわち）のキャリブレーションに基づいて、マイクロメートルにピクセルを変換します。顕微鏡およびこれらの実験で使用した設定については、40倍目標は1ピクセル= 0.298μmのキャリブレーションを与え、無ズームで使用されました。三次元での原発腫瘍（X1、Y1、Z1）と各IGのパラメータを与える（最初のIGのためのX2、Y2、Z2例）Excelスプレッドシートにデータをインポートします。
12. 原発腫瘍の中心から各IG用ミクロンの侵攻の距離は、式√を（（X2 - ^X1）2 +（Y2 - ^Y1）2 +（Z2 - ^Z1）2）を使用して計算されます。
13. 腫瘍浸潤性指数は、（T _I）式T _I = N _T X V _T ×奥行_T、N、T =画像のIGSの合計数、V _T =すべてのIGSの合計量、D _Tを使用して計算されます=総走行距離は、原発腫瘍の中心部からすべての侵襲的なグループの旅。

8。ニコンNIS - Elementsシリーズはソフトウェアと三次元のレンダリング

1. より地形ディテールを持つ3つの次元のレンダリングは、ニコンNIS - Elementsシリーズはソフトウェアに腫瘍全体のイメージの元の16ビットのモノクロTIFFファイルをインポートして生成することができますパッケージ（ニコン、メルヴィル、ニューヨーク州）。その後、"ND"、"File"を選択し、次に"ファイルのシーケンスからNDファイルを作成します"。 TIFF Zシリーズの画像スタックを選択し、適切なステップサイズを指定します。
2. xy平面上のNDの文書を校正します。マニュアルキャリブレーションを使用して1つのピクセルのサイズを指定します。
3. "ボリュームの表示"を選択します。より高い品質に対してz平面上の追加のスライスを計算するために"HQ"機能を使用してください。 "3Dレンダラー設定"で、"超高詳細"と"フル解像度"の品質で"高度なレンダラ"を使用。腫瘍表面を強調する"アルファブレンディング"を選択します。
4. プレゼンテーションのための三次元画像を最適化します。必要に応じて腫瘍と関連するIGSと作物上でズーム。のxyz平面内で画像を回転させるとLUTを調整する。
5. プレゼンテーション用のイメージをキャプチャします。 "編集​​ - ビューの作成スナップショットを（8ビットRGB）"を選択します。それに応じてファイルに名前を付けて保存します。

9。代表的な結果

図1。同所舌の腫瘍の生産とその場二光子イメージングの主要なステップを示す全体概略図。

図2マウスの舌にOSC19発現細胞LifeAct - mCherryの注入。

図3切除腫瘍を含むマウスの舌は、2光子イメージングのための準備。

図4。イメージングのための準備ができて二光子顕微鏡の位置で腫瘍を含む舌のオリエンテーション。

図5。scanimageでも、初期の二光子画像の生データの取得を証明するから撮影代表画面。

図6。同所OSC19の腫瘍の画像解析と腫瘍浸潤の定量化。アミラVoltexのレンダリング（）と単閾値のz -セクションの代表的なスクリーンショットの画像（B）青で概説紫、侵襲性グループ1（IG - 1）に記載されている主な原発腫瘍と、赤とIGに記載されているIG - 2 -3は、識別の手順の例として、緑色で概説。矢印がでIGSを表す（A）と（B）。ボリュームのC.プロットに対する腫瘍浸潤のインデックス（Ti）を計算するために使用される8個々のIGSの距離を侵略した。

図7。腫瘍の代表画像は、従来のIHCのアプローチからの画像と比較して、このプロトコルの腫瘍グループを侵略した。UMSCC1同所腫瘍を保有する全体のマウスの舌のA.パラフィンセクション。免疫組織化学的染色は、HNSCC特異的細胞マーカーEMMPRIN（Zymed社、猫＃34〜5600）に対する一次抗体で、従来の手順を用いて実施された1:1000希釈でとOmniMap DAB抗Rbの検出キット（Ventanaの猫＃760を使用して可視化-149）は鉄ヘマトキシリン​​染色が続く。総舌領域を包含する画像はオプトロニクスMicroFire CCDカメラでオリンパスZX70プロビス顕微鏡で4Xの倍率で個別に収集し、StereoINvestigatorイメージングパッケージを（MBFバイオサイエンス）を用いて再建された。腫瘍は舌の先端で明らかである。侵襲的なフロントおよび個々の腫瘍細胞群（矢印）を示す拡大地域は、代表的なOSC19の腫瘍の（B）。C.ニコンNIS - Elementsのレンダリングで表示されます。強化された輪郭の詳細とIGSの明確な可視化（矢印）が明らかである。すべての画像のバー= 100μmの。

ディスカッション

同所性マウスモデルでは、頭頸部癌の^1,2の多くの側面を研究するために有用であることが証明されている。私たちは、頭頸部腫瘍細胞の浸潤の初期の事象を研究するためのシステムとしてmCherry -標識細胞の二光子顕微鏡イメージングとSCOT ³の十分に確立された同所のシステムを組み合わせている。この手順では、我々は細胞が特に不足して舌の大きさのためにマウスの6週間若いに、腫瘍注射部位から漏れることができることに留意している。我々はこの問題を回避するためにそれ以上の年齢のマウスを使用してください。それ以上の年齢のマウスでより大きな舌の大きさにも舌から舌動脈と過度の出血の破裂を避けるためにも役立ちます。舌が飛躍的に最初の注射部位での膨潤時に腫瘍のテイクが大幅に強化されています。注入液が吸収されるので、これは一から二時間以内におさまるの腫れ。腫瘍の成長は、舌の表面に小さな白いバンプとして指示された注入さ細胞数で明らかに1〜2週間後に注射をされます。我々はまた、ここで紹介私たちの研究で使用されている40X目的で、我々は個々の腫瘍細胞を区別することはできませんが、HNSCC侵入の典型的なモードを再現侵襲的な細胞クラスターとしてIGSを識別することにも注意してください。

このモデルを今日まで広範囲に監視さ頸部リンパ節転移により測定された効果は、IHCまたは生物発光の方法^4-7を使用^して、SCOT成長上の特定の分子だけでなく、いくつかの抗腫瘍薬の役割侵入をテストするために使用されています。腫瘍は浸潤性多細胞クラスターとしてその場で画像全体の腫瘍への二光子顕微鏡の応用を可能にする、近い舌の表面（図7）にこのシステムのマニフェストに形成。手順は、携帯電話の解像度と腫瘍浸潤を可視化するために利用することができます。二光子顕微鏡は、以前は同所^8,9および異種移植^8,10モデルで頭頸部癌のための実験的な治療法を研究するために利用されている。しかし、これらの報告と我々のプロトコルには、2つの大きな違いがあります。最初に、これらの研究はおそらく循環への十分なアクセス権を持つ唯一の腫瘍細胞に検出を制限し、頭頸部腫瘍細胞を標的/識別するために、細胞外のラベルを使用してください。早期の転移活性は、実験パラメータとして評価されていない可能性が反復することに近いプライマリサイトへの腫瘍細胞の第二、侵略。我々のプロトコルは、直接マウスの舌に腫瘍の進行中の任意の時点で腫瘍細胞の浸潤を定量化する機能を提供します。ここで説明する方法は解剖舌を使って手順を説明しながら、我々は、同時に初期の浸潤、局所リンパ節転移との遠隔転移を監視するために生物発光との組み合わせで使用するための生きたマウスで画像の腫瘍の浸潤にこの方法を適応させるプロセスで、現在です。同じ動物。 in vivoイメージングのためのプロトコルへの変更は撮像中にマウスを配置し、維持するための適切な段階だけでなく、適切に画像処理手順の実行中に麻酔したマウスの口腔内を灌漑するための実用的なシステムの設計が必要です。一度に最適化された、これらの適応は、潜在的なプロ侵襲的分子とテスト抗浸潤局所浸潤に対する化合物および拡張期間にわたって動物のより多くの遠隔転移の関与の役割を研究する能力を提供します。