Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Özet

Etiketli hücreleri çok foton mikroskobu ile dil içinde ağız kanseri ve tümör invazyonu niceliksel olarak izlenmesi bir fare modeli üreten yer alan tekniklerin kapsamlı bir bakış sunulmaktadır. Bu sistem, anti-invaziv bileşiklerin moleküler değerlendirme ve ilaç etkinliği için faydalı bir platform olarak hizmet verebilir.

Özet

Loco-bölgesel işgali baş ve boyun kanseri metastaz riski ile bağlantılı ve hasta yönetimi stratejilerinin tasarımı ve uygulanması konusunda zor bir meydan okuma sunuyor. Ağız kanseri Ortotopik fare modelleri, bu faktörlerin çalışma kolaylaştırmak için geliştirilmiştir etkisi işgali ve anti-tümör terapatikler değerlendirmek için model sistem olarak hizmet. Bu sistemlerde, oral kavite dokularında içinde dissemine tümör hücrelerinin görselleştirme genellikle geleneksel histoloji ya da in vivo bioluminescent yöntemleri ile yapılmıştır. Bu tekniklerin doğru üç boyutlu birincil sitesinden kaynaklanan erken tümör hücresi invazyonu görselleştirmek ve ölçmek için birincil dezavantajı doğasında yetersizlik. Burada dilli tümörün yayılması çok vektörel görselleştirme izin iki foton görüntüleme ile dil skuamöz hücreli karsinom (Scot) için kurulmuş bir model birleştiren bir protokol açıklar. OSC-19 baş ve boyun tümör hücre hattı, stabil bir şekilde mCherry floresan protein (LifeAct mCherry) erimiş F-aktin bağlayıcı peptid LifeAct ifade etmek için tasarlanmıştır. Bu hücreler enjekte Fox1 ^{nu / nu} fareler güvenilir dil iki foton mikroskopi ex-vivo uygulama tarafından görüntülendi izin tümörleri oluşturur. Bu teknik, tümör kitlesi ortotopik görünüm için ve yerel, bölgesel tümör mikroçevresinin aksamadan eksize dilleri hücreleri istila sağlar. Buna ek olarak, bu sistem birincil tümör hücreleri hareket işgal mesafeleri hesaplanarak tümör hücresi invazyonu miktarının sağlar. Genel olarak bu işlem için geliştirilmiş bir model sistem Scot işgali ve tedavi tedaviler, lokal invazyon ve uzak metastatik yayılmasını önlemek için özel katkıda bulunan faktörler analiz sağlar. Bu yöntem de, sonuçta bir in vivo ortamda diğer görüntüleme yöntemleri ile kombine edilebilir potansiyele sahiptir.

Protokol

1. Hücre Hatları, Vektör İnşaat ve lentiviral Üretim

1. İnsan baş ve boyun tümör hücreleri hatları (OSC19 veya UMSCC1)% 10 fetal sığır serumu FBS (Hyclone kedi # SH30070.03),% 1 penisilin ile desteklenebilir (Cellgro kedi # 50-003-PB) DMEM oluşan eksiksiz bir medya kültüre edildi / streptomisin (Cellgro kedi # 30-002-CI), ve% 1 non-esansiyel amino asitleri (Cellgro kedi # 25-025-CI).
2. PLL7.0 lentiviral vektör LifeAct-mCherry kodlama sırası aktarmak için, ebeveyn mCherry cDNA Sbf1 tanıma site site mutagenez (Stratagene kedi # 200.518-5) kullanarak tanıma dizisi içine üç sessiz mutasyonlar getirerek değişmiş oldu. Sonra çıkan değiştirilmiş LifeAct mCherry dizisi PCR EcoR1/Sbf1 siteleri yanındaki ile amplifiye ve pLL7.0 LifeAct mCherry bir yapı oluşturmak için pLL7.0 içine subcloned.

2. pLL7.0-LifeAct mCherry Virüs Üretim

1. Viral üretim lentiviral İfade Sistemleri manuel (Sistem Bioscience sürümü 2-051.018) göre yapılmıştır.
2. Ambalaj hücre hattı 293T/17 hücreleri (ATCC kedi # CRL-11268)% 40, HNSCC hatları için kullanılan aynı eksiksiz bir medya izdiham büyüdü.
3. Hücreler, sırasıyla (Clontech kedi # 631.312) CalPhos kullanarak pLL7.0 LifeAct-mCherry, psPAX2, 03:02:01 oranı pVSV-G vektörleri ile transfekte.
4. 24 saat sonra, transfeksiyon ilk medya taze medya ile değiştirildi.
5. Medya daha sonra toplanan ve doldurulan her 12 saat 72 saat boyunca ve 4 ° C'de saklanan

3. Kararlı LifeAct mCherry İfade Baş ve Boyun Hücre Hatları Üretim

1. Toplanan medya 4 10 dakika 2000 rpm'de spun ° C
2. Bir ml virüs içeren açıklık medya doğrudan 12 saat OSC19 veya UMSCC1 hücreleri eklendi. Hücreler daha sonra durulanır ve bir virüs ek bir ml, başka bir 12 saatlik süre eklendi.
3. Hücreler dirençli koloniler seçmek için iki hafta boyunca 200mg/ml puromycin içeren medya ile tedavi edildi.
4. Surviving klonlar LifeAct-mCherry ifade floresan mikroskobu ile görsel olarak tarandı. Bireysel pozitif koloniler steril 3mm klonlama diskler (Fisher kedi # 0790710A) kullanarak typsinized.
5. Pozitif hücreleri geri dondurulmuş veya ortotopik enjeksiyon için kullanılan kadar 200mg/ml puromycin içeren medya tutuldu.

4. Ortotopik Tümör Xenograftlarında Oluşumu

1. Bütün hayvan prosedürleri, West Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan (09-0821) ile bir protokol uyarınca yapılmıştır.
2. LifeAct mCherry ifade tümör hücrelerinin, tripsinize santrifüj ve 2.5 x 10 ⁴ hücreler 50 mcL eksiksiz bir medya yeniden süspanse idi.
3. Tümör hücreleri, 27 bağlı bir ml şırınga ½ iğne içine yüklenmiştir.
4. Bayan atimik Fox1 ^{nu / nu} fareler yaşı 8 hafta (Harlan Laboratuvarlar), 80mg/kg ketamin ve 10mg/kg ksilizin kombinasyonu ile anesteziye edildi . Anestezi fareler bir ısıtma yastığı 37-40 ° C arasında muhafaza edildi.
5. Steril forseps kullanarak, dil ucu hafifçe kavradı ve oral kavite dikkatlice dışarı çıkardı.
6. Hücreler yavaş yavaş dilli arterler kaçınarak, dil merkezinde soğanlı bir kitle oluşturmak için her dilin bir yan içine enjekte edildi.
7. Fareler 2.1mg/kg yohimbin ile enjekte edilen ve anestezi kurtarma sırasında 2-3 saat takip edildi ısıtma yastığı için iade edildi.
8. Canlandırıldı sonra, fareler, yumuşak bir transgenik hamur diyet (Bioserve kedi # S3472) içeren steril kafeslere yerleştirilmiştir.
9. Fare 2-3 günde tartılır ve tümör başlangıcı için görsel olarak monitörize edildi.

5. Ex-vivo Görüntüleme Mouse Dilleri hazırlanması

1. Farklı zaman noktalarında (enjeksiyon sonrası genellikle 2-4 hafta) tümörler barındıran Fare karbondioksit Solunduğunda ötenazi uygulandı.
2. Dilleri, ayıklanan 1X PBS ile durulanır ve monofilaman dikiş ipliği, yerel bir hobi dükkan ve bir boyutu 8 dikiş iğnesi kullanarak geleneksel bir parafin doku gömme kaseti bir tarafında (StatLab Cat # H104) bağlıydık.
3. Dilleri immobilize sonra, tüm kaset montaj 30mm doku kültürü çanak yerleştirilir ve 1X PBS dalmış.
4. İşlenmiş dilleri hemen iki foton uyarma mikroskopi için kullanılmıştır.

6. İki foton Mikroskopi Dil Tümörleri görüntüleme

1. Dil kasetleri, dik bir mikroskobu (Sutter Aletleri Hareketli Mikroskobu (MOM)) amacı altında konumlandırılmış bir geri çekilebilir manivela kolu (Oda Servisi, Siskiyou enstrümanlar) özel olarak tasarlanmış bir tutucu güvenli 1X PBS içeren bir 60mm çanak batmış.
2. 40X/0.8NA suya daldırma objektif lens görünür tum on veya üzerinde doğrudan yerleştirildiveya lezyonlar. Safir lazer yoğunluğu 60 mW ve 755 nm dalga boyu giriş mCherry sinyali optimize etmek için (Mira, Tutarlı): Dilleri Ti ile iki foton mikroskobu ile görüntülenmiş.
3. Seri 1mm lazer tarama görüntüleri, toplam 15 ve 100 mikron (tümör hacmine göre) arasında bir doku derinliği üzerinde 1 mikron artan derinliklerde toplanmıştır. Görüntüler ScanImage, Karel Svoboda laboratuvar (Janelia Çiftlikleri, HHMI) tarafından geliştirilen MATLAB platformu dayalı bir açık kaynak programı kullanarak ele geçirildi. ScanImage raster tarama desen x / y galvanometric tarama aynaları kontrol etmek için iki kanallı bir çıkış oluşturur ve aynı zamanda bir veri toplama kartı (PCI-6610S ile photomultiplier tüpleri (Proje Yönetim Ekipleri) aynı anda maksimum dört-kanallı sinyal girişi yakalar National Instruments). PMT sinyalleri monitör ekranında görüntülemek için NI-DAQ kurulu besleyen önce düşük gürültü akımı preamplisi (SR570, Stanford Araştırma Sistemi) tarafından güçlendirilir. ScanImage amacı z-ekseni kontrol z yığın görüntüleri toplar ve tek bir ya da çevrim modunda zaman atlamalı görüntüleri toplar. Görüntüler tek bir TIFF dosyası 16 bit derinliği kaydedildi.

7. Amira Yazılımı kullanarak Görüntü Analizi

1. Tümör ölçümü için Amira görüntüleme: Aimra yazılım, z-yığın görüntü kümesini içeren bir TIFF dosyası açın.
2. Dosya adını vurgulayın ve üç boyutlu render oluşturmak için Voltex işlevi uygulamak. Toplu işgal hücrelerin birkaç küçük, ayrışmış invaziv gruplar (IG) ile büyük bir primer tümörün görüntü işlenen görüntü tipik olarak görülür (Şekil 6A).
3. Primer tümörün kitle seçmek için, sonra, "Etiket Alan" Etiketleme "," Open Data "seçeneğini seçin.
4. Birincil Eşikleme tüm z-yığın fotoğraf tümör seçin ve üç boyutlu içinde sadece primer tümörün kitle dahil sağlamak için z-düzlemi görüntüleri kaydırmak. Bu genellikle alanında büyük boyutlu görüntü ve sık sık, görüntülü z-düzlemi ile geçiş olarak bölümlenmiş görünür.
5. Eşiğe doğru ve görüntü atarak herhangi bir tümör sinyal vermeden bunu ortadan kaldırmak için sihirli değnek / eşik fonksiyonu kullanın. "Inside Dosya" etiketi vurgulayın ve ⊕ düğmesini tıklatın. "Tüm Dilimler" onay kutusunu seçin. Bu her z yığın artış eşiklenir primer tümör alanı çevresinde renkli bir sınır oluşturur.
6. ÇK seçmek için, "Yeni" fonksiyonunu seçin. Bir tek IG seçin ve z-düzlemi kaydırma primer tümör ile ilişkili değildir sağlamak.
7. "Tüm Dilimler" seçin ve ⊕ düğmesini tıklatın. Dosya (IG 1 ex) yeniden adlandırın
8. 7.4 eşikleme prosedürü tekrarlayın ve belirlenen IG 7.5 vurgulayarak adım. Primer tümörün kitle belirtmek için kullanılan renk farklı bir anahat rengini seçin.
9. Z-düzlemi ile tüm ÇK belirtilir sağlamak için tarama, görüntü boyunca her ek IG için gerekli tekrarlayın. Resmin üzerine gelecek tanımlama, her bir tespit IG yardımcıları için farklı renkler kullanma.
10. Primer tümörün ve tüm ÇK seçilir sonra, açılan menüden "Segmentasyon" seçeneğini seçin, daha sonra "Malzeme İstatistikleri" seçeneğini seçin. Bu hacim ölçümü yanı sıra, X, Y ve X tümör çekirdek merkezi tümör noktadan ÇK mesafeler hesaplamak için primer tümörün koordinatları sağlar.
11. Hacimleri hesaplandı, primer tümörün merkezi bir çekirdek, her IG mesafeyi belirlemek. Sonra "Segmentasyon", "Malzeme İstatistikleri" seçin. Bu adım, tüm ölçümler piksel içine hesaplar. Mikroskop objektif kalibrasyon ve büyütme (zoom fonksiyonları gibi) herhangi bir ek artış dayalı mikrometre piksel dönüştürün. Bu deneylerde kullanılan mikroskop ve ayarları için, 1 piksel = 0,298 mm 40X objektif bir kalibrasyon vererek, herhangi bir zoom ile kullanılmıştır. Primer tümörün üç boyutlu (X1, Y1, Z1) ve her IG (X2, Y2, ilk IG Z2 eski) parametreleri veren bir Excel elektronik tablo, veri alma.
12. Primer tümörün merkezinde her IG mikron işgal mesafe, formül √ ^((X2-X1) 2 + ^{(Y2-Y1) 2} + ^(Z2-Z1) 2) kullanılarak hesaplanır .
13. Tümör invaziv indeksi _(T) T _I = N _T x V _T x D _T, N _T = görüntü ÇK toplam sayısı, V _T = tüm ÇK toplam hacmi, D _T formülü kullanılarak hesaplanır. = toplam mesafe, primer tümörün merkezi tüm invaziv grupların gitti.

8. Nikon NIS-Elements Yazılım Üç boyutlu render

1. Üç boyutlu render Nikon NIS-Elements yazılımı içine tümörün tamamını görüntü siyah-beyaz orijinal 16-bit TIFF dosyaları ithal ederek, daha fazla topografik ayrıntı elde edilebilirpaketi (Nikon, Melville, NY). "File" seçeneğini seçin, ardından "ND", sonra "Dosya Sıra ND Dosya oluşturma". TIFF z serisi görüntü yığını seçin ve uygun adım boyutu belirtin.
2. Xy düzleminde ND belge Kalibre. Manuel kalibrasyon kullanarak bir piksel boyutunu belirtin.
3. "Volume View" seçin. "HQ" fonksiyonu, yüksek kalite için z-düzleminde ek dilimler hesaplamak için kullanın. "3D Renderer Ayarlar" "Gelişmiş Renderer", "Ultra Yüksek Detayları" ve "Tam Çözüm" kalitede kullanın. Tümör yüzeyler vurgulamak için "Alpha Blending" seçin.
4. Sunum için üç boyutlu görüntü optimize edin. Tümör ve ilişkili ÇK ve gerektiği gibi bitki Zoom. Xyz uçakları görüntü döndürün ve LUT ayarlayabilirsiniz.
5. Sunum için görüntü yakalayın. "Düzen-Görünüm Oluştur Snapshot (8 bit RGB)" seçeneğini seçin. Adı ve buna göre dosyayı kaydedin.

9 - Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Genel şematik ortotopik dil tümör üretimi ve in situ iki foton görüntüleme önemli adımlar gösteren.

Şekil 2 fare dillerine OSC19 hücreleri ifade LifeAct-mCherry Enjeksiyon.

Şekil 3 Rezeke tümör içeren fare dil iki foton görüntüleme için hazırlanmıştır.

Şekil 4 içeren bir tümör görüntüleme için hazır bir iki foton mikroskopi pozisyon dil Oryantasyon.

Şekil 5 ScanImage gösteren ilk iki foton görüntü ham veri toplama vuruldu Temsilcisi ekran.

Şekil 6 ortotopik OSC19 tümörü Görüntü analizi ve tümör invazyonu ölçümü. Amira Voltex render (A) ve tek bir eşiklenir z-bölüm Temsilcisi ekran görüntüsü görüntüleri (B) birincil primer tümör ile özetlenen, mavi özetlenen, mor, invaziv grup 1 (IG-1), IG-2 kırmızı ve IG özetlenen -3 yeşil tanımlama prosedürü bir örnek olarak sıraladı. Arrowheads ÇK ifade eden (A) ve (B) C. hacim Arsalar karşı tümör invazyonu indeksi (Ti) hesaplamak için kullanılan sekiz ayrı ÇK için mesafe işgal etti.

Şekil 7 Temsilcisi tümörlerin görüntüleri ve görüntüleri, geleneksel bir IHC yaklaşım ile karşılaştırıldığında bu protokolü tümör grupları işgal etti. UMSCC1 ortotopik tümör barındıran bütün bir fare dil A. Parafin bölümü . Immünohistokimyasal boyama HNSCC özel hücre işaretleyici emmprin (Zymed; kedi # 34-5600) karşı primer antikor ile geleneksel prosedürleri kullanarak yapılmıştır 1:1000 dilüsyon ve OmniMap DAB anti-Rb algılama kiti (Ventana kedi # 760 kullanılarak görüntülendi -149) tarafından demir hematoksilen boyama izledi. Görüntüler toplam dil alanı kapsayan bir Optronics MicroFire CCD kamera ile bir Olympus ZX70 Provis mikroskop 4X büyütme tek tek toplanır ve StereoINvestigator görüntüleme paketi (Bioscience MBF) kullanılarak yeniden inşa edildi. Tümör dil ucunda açıktır. Invaziv ön ve bireysel tümör hücre grupları (ok) gösteren genişlemiş bir bölge temsilcisi OSC19 bir tümör (B) C. Nikon NIS-Elements render gösterilmiştir. Gelişmiş kontur detay ve ÇK açık görselleştirme (ok başları) açıktır. Tüm görüntüleri bar = 100 mm.

Tartışmalar

Ortotopik fare modelleri, baş ve boyun ^kanseri 1,2 birçok açıdan inceleyerek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır . Biz Scot ³ ortotopik sistemi iyi kurulmuş bir baş ve boyun tümör hücresi invazyonu erken olayları incelemek için bir sistem olarak mCherry etiketli hücreleri iki foton mikroskobu görüntüleme ile kombine var. Bu yöntemde, hücreler özellikle altı hafta ya da daha küçük, yetersiz dil boyutu nedeniyle farelerin tümör enjeksiyon sitesinden sızıntı olabilir kaydetti var. Biz bu sorunu önlemek için, yaşlı farelerin kullanın. Yaşlı farelerin büyük dil büyüklüğü, aynı zamanda dil lingual arter ve aşırı kanama rüptürü kaçınarak yardımcı olur. Tümörü almak, dil dramatik ilk enjeksiyon yerinde şişer büyük ölçüde geliştirilebilir. Bu şişlik azalır enjekte edilen sıvı olarak bir-iki saat içinde emilir. Tümör büyüme dil yüzeyinde küçük beyaz bir yumru olarak belirtilen enjekte hücre sayısı belirgin bir-iki hafta enjeksiyon görünür. Ayrıca burada sunulan çalışmalarda kullanılan 40X amacı, bireysel tümör hücreleri ayırt edemez ama ÇK HNSCC işgali tipik modu özetlemek invaziv hücre kümeleri olarak tanımlar olduğunu unutmayın.

Bugüne kadar bu model kapsamlı ^4-7 IHC veya bioluminescent yöntemleri kullanılarak izlenir servikal lenf nodu metastazı ile ölçülen etkinlik, belirli molekülleri rol Scot büyüme bir işgalinden birkaç anti-tümör ilaçların yanı sıra test etmek için kullanılır olmuştur. Tümörler, bütün tümörler invaziv çok hücreli kümeleri gibi yerinde görüntü iki foton mikroskopi uygulama sağlayan, bu sistem tezahür yakın dil yüzeyi (Şekil 7) kurdu. Prosedürü de hücresel çözünürlük ile tümör invazyonu görselleştirmek için de kullanılabilir. İki foton mikroskopi ortotopik ^8,9 ve ^8,10 modelleri xenograft baş ve boyun kanseri için deneysel tedaviler daha önce çalışmak için kullanılmıştır. Ancak, bu raporlar ve protokol arasında iki önemli fark vardır. İlk olarak, bu çalışmalarda hedef / muhtemelen dolaşımı için yeterli erişim, sadece tümör hücreleri algılama sınırlayıcı, baş ve boyun tümör hücreleri tanımlamak için ekstrasellüler etiketleri kullanmayın. İkinci olarak, birincil siteye yakın tümör hücrelerinin muhtemel özetlediği erken metastatik etkinliği deneysel bir parametre olarak değerlendirilmektedir olmadığını işgali. Bizim protokol fare dilleri tümör ilerlemesi esnasında herhangi bir noktada doğrudan tümör hücresi invazyonu ölçmek için yeteneği sağlar. Burada anlatılan yöntem disseke dillerini kullanarak prosedürü açıklar iken, biz henüz erken invazyon, lokal lenf nodu tutulumu ve uzak metastaz aynı anda izlemek, biyoparlaklık ile birlikte kullanmak için canlı farelerde görüntü tümör invazyonu için bu yöntemi uyum sürecinde aynı hayvan. In vivo görüntüleme için protokol değişiklikler yanı sıra pratik bir sistem olarak düzgün görüntüleme işlemi sırasında anestezi farelerde oral kavite sulamak için, görüntüleme sırasında fareler konumlandırma için uygun bir sahne tasarımı ve bakımı gerektirir. Optimize sonra, bu uyarlamalar potansiyel pro-invaziv moleküller ve yerel işgali ve daha uzun süreler boyunca hayvanların daha uzak metastatik tutulum test anti-invaziv bileşiklerin rolü çalışma imkanı sağlayacaktır.