人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

要約

この記事では、人間の毛包からの神経堤幹細胞の単離および培養のための堅牢なプロトコルを提案する。

要約

毛包は、生涯成長を受け、毛周期は、幹細胞の増殖と休止を伴うよく制御されたプロセスである。髪の膨らみは、成体幹細胞¹のためのよく特徴付けニッチです。外毛根鞘のこのセグメントは、上皮幹細胞^2、色素幹細胞³と^4-7幹細胞のような神経堤幹細胞を含む、さまざまな種類の数が含まれています。毛包は、ヒト幹細胞の種類ごとにアクセス可能で、豊富な情報源を表しています。我々や他のは、人間の胎児と成人の毛包からの神経堤幹細胞^{（NCSCs）4,5}単離した。これらのヒト幹細胞は、ラベル保細胞であり、in vitroにおける非対称細胞分裂を介して自己複製することが可能である。彼らは未熟な神経堤細胞のマーカーではなく、分化マーカーを発現している。当社の発現プロファイリングのための研究では、彼らがマウス皮膚未熟な神経CREと同様の遺伝子発現パターンを共有していることを示したstの細胞。彼らは 、in vitroクローン単一細胞培養での後、筋原性メラニン細胞、および神経細胞系譜を生じさせることができるクローンの多能性を示す。分化した細胞は、系統特異的マーカーを取得するだけでなく、ex vivoでの条件で適切な機能を発揮しないだけ。さらに、これらのNCSCsは間葉系統に向かって分化能を示しています。分化した神経細胞は、マウスの脳に固執し、ニューロンの分化マーカーを保持することができます。それは髪がNCSCsが神経再生を助けることができる派生卵胞、そして、彼らはtransecting脊髄損傷⁸以下、これらの幹細胞を移植したマウスの運動機能を改善することが示されている。さらに、末梢神経は、幹細胞移植片⁹と、押しつぶさ坐骨神経に隣接する皮膚由来前駆細胞の移植で修復されました再ミエリン¹⁰をもたらした。そのため、毛包/皮膚由来NCSCsはすでにRのための有望な結果が示されている前臨床モデルでegenerative療法。

人工多能性幹（iPS）細胞に再プログラミング体細胞は、再生医療のための巨大な可能性を示している。しかし、癌遺伝子/ウイルス統合および多能性幹細胞の潜在的な発癌性の長期的な効果が十分に対処されていない特に、iPS細胞に関する多くの問題は、まだあります。 iPS細胞は再生医療に使用することができます前に、克服すべき多くのハードルが残っています。成体幹細胞は、安全であることが知られており、それらはそのような骨髄移植のように、長年にわたり臨床的に使用されなければならないということです。多くの患者は、すでに治療の恩恵を受けている。自家成体幹細胞はまだ移植に適した細胞である。したがって、ヒトの皮膚/毛包において容易にアクセス可能で、拡張可能な成体幹細胞は、再生医療のための貴重な情報源です。

プロトコル

1。組織培養プレートの作製

1. コー​​トはそれぞれに良く、ポリ-D-リジン（PDL）は井戸の底をカバーするのに十分。プレートがボンネットに乾燥することができます。
2. 井戸が乾燥した後、滅菌水で洗い流して、吸引します。プレートがボンネットに乾燥することができます。
3. 時フィブロネクチンと乾燥、コート（6ミリリットルで1ミリグラムの濃度で37℃で一晩biowhittakerの水に溶解したもの）。
4. NCSC媒体を加える[95ミリリットルDMEM/F12、1ミリリットルペン/ストレプトマイシン（P / S）、1mlのN2は、2ミリリットルB27、100μlのメルカプトエタノール（2ME、50mMのストック）は、bFGF（20 ng / mlの培地）、IGF -1（20 / NG媒体のml）およびEGF（20 ngの/培地1ml）]プレートで乾燥したフィブロネクチンの前に、

2。人間の頭皮から毛包細胞を抽出

1. 隔離NCSCsの手順を開始する前に、1（ 表1参照） は 、それぞれのメディアと試薬を準備する必要があります。
2. フェイスリフトの手順やFEから新鮮なヒト成人頭皮TAL頭皮組織をPBSでペニシリン - ストレプトマイシンを含むで洗浄し、収集されます。
3. 皮膚を50 mlチューブに移し、4℃で一晩ディスパーゼ（10 mg / ml）を含むDMEM中で培養される37℃で2〜4時間のインキュベーション℃のも効果的です。皮膚片は、酵素が浸透することを可能にするために1cmの最大幅でなければなりません。
4. 滅菌シャーレに皮膚を移し、皮膚表面の近くに毛幹をつかみ、しっかりとスムーズに引っ張ることによって皮膚からそれぞれの髪をやってのける。毛包が成長期（ 図1A）または休止（ 図1B）のいずれかの形態を示している。
5. 定期的に振とうしながら室温で15〜20分間0.05％トリプシン-EDTA（Invitrogen）中で孤立した卵胞の断片をインキュベートし、反応を停止し、10％FBSを含むDMEM 4ミリリットルを追加します。濾胞上皮をトリプシン処理し、様々なサイズと形状の細胞を含む単細胞懸濁液を得るために、フィルタは40μmで濾過する。
6. スピン5分間、200×gで、1 mlのPBSで2％血清（FBS）を含むで再懸濁、慎重に上清を捨てる。
7. 代わりに、羽をむしられた毛包は、 その場で毛球を成長させるためにトリプシン消化することなく、文化に配置することができます。

3。フローサイトメトリー細胞選別を使用した毛包NCSCsの分離

1. 毛包単細胞懸濁液をトリプシン消化により得られ、暗闇の中で氷上で40分間CD271（APC標識）/ HNK1（FITC-結合）またはCD271 / alpha4インテグリン（PE-結合）に対する抗体を用いて標識した。
2. 室温で200×gで5分間遠心し、上清を吸引除去する。
3. 2パーセント血清（FBS）を含むPBSで細胞を再懸濁して、ソート前に、PIは、死んだ細胞アウトゲートに追加されます。
4. フローサイトメトリー（FACS）による細胞選別を行います。 CD271 +、HNK1 +ダブルポジティブ細胞またはCD271 +、alpha4インテグリン+二重陽性細胞（ 図2）を収集します。
5. ソート後り、CD271 +、HNK1 +ダブルポジティブ細胞またはCD271 +、alpha4インテグリン+二重陽性細胞がNCSC培地で超低アタッチメントプレート中で培養される

4。プライマリNCSCsの文化

1. NCSC培地中で超低アタッチメントプレートに細胞をソート文化引き離され濾胞細胞またはFACSは、毎日培地を変更してください。
2. 顕微鏡下で毎日細胞培養を確認してください。 NCSCsは、ドナー（ 図3A）の年齢に応じて培養液中で2〜5週間で数日間と整形球後に浮動小凝集体を形成するために開始されます。伸長はバルジ領域と数週間でin situで整形球（ 図3B）全体の毛包がNCSC培地中で培養さで数日内に表示されます。

5。 NCSCsの拡大

1. 一度PBSで細胞を洗浄します。
2. あらかじめ温めておいた追加（〜37℃、クリティカル）で37 accutaseインキュベートし5〜10℃のC単一のセル（アタッチメント培養NCSCのため、37℃でインキュベートaccutase細胞℃で5分間、毛包幹細胞が切り離さかどうかを確認するため）に解離してください神経幹細胞の球体を作るために定期的に振とうしながら分。
3. 残っaccutaseソリューションを削除するDMEM/F12培地において室温で200×gで5分間細胞を2回洗浄し、遠心分離する。
4. NCSC培地で細胞を再懸濁する。
5. 浮遊培養では、超低アタッチメントプレートに細胞を入れた。添付ファイルのカルチャでは、前処理された組織培養プレートに細胞を入れた。

6。代表的な結果

NCSC培地はフィーダー細胞を必要とせずに、未分化状態でhNCSCsを維持するのに十分である。ケラチノサイトは増殖し、徐々に培地中に死亡したことはありません。特定の小円形細胞が増殖し、3から5日後に、懸濁液中の小さな凝集体を形成することになる。これらの浮遊凝集体が徐々にiを増加我々は毛球（ 図3A）と呼ばれるn個のサイズ、生成された三次元の球体状の構造、。コー​​ティングされたプレートで培養した場合、NCSCsは、表面に付着し、どんな球を形成しません。添付NCSCsは、懸濁液中よりも速く成長します。球形成または接続された幹細胞はNCSCsマーカーを発現している。全体の毛包が文化である場合、球はバルジ領域（ 図3B）に対応する領域に形成されている。

図1。成長期（）および休止期（B）が毛包を羽をむしられた。

図2。 NCSCsのFACS分析の代表的な画像左のパネル：。細胞は、抗CD271と抗alphe 4インテグリン抗体を用いて、ゲートされています。右のパネル：細胞は、抗CD271と抗HNK1抗体を用いてゲートさ。

図3。毛球の形態浮遊毛球、左パネルの（A）の形態：低消費電力、右のパネル：ハイパワー（B）はバルジ領域、左側のパネルで、in situで毛球の形態学：休止期の膨らみの毛球、右のパネル：成長期毛包のバルジ領域の毛球。

ディスカッション

記載の細胞単離および培養方法は再現性があり、堅牢です。私たちは、幅広い年齢層を横断して、個人の数十からNCSCsを生成している。それが右の組織の収穫後に組織を処理するのが最善の方法ですが、私たちは、頭皮の組織が安全に、細胞生存率への影響を最小限に抑えて一晩輸送のための氷の上でメディアに格納することができることがわかった。

抗生物質で、頭皮...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Table 1.