Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса

Резюме

Данная статья представляет собой надежный протокол для изоляции и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческого волоса.

Аннотация

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells¹. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells², melanocyte stem cells³ and neural crest like stem cells^4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles^4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury⁸. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts⁹, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination¹⁰. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.

Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

протокол

1. Подготовка пластин тканевой культуры

1. Пальто каждую лунку с достаточно поли-D-лизин (PDL), чтобы покрыть дно скважины. Разрешить пластин для просушки на капоте.
2. После того, как скважины сухие, промыть стерильной водой и аспирации. Разрешить пластин для просушки на капоте.
3. При сухой, пальто с фибронектин (который растворяют в воде BioWhittaker течение ночи при 37 ° C при концентрации 1 мг в 6 мл).
4. Добавить NCSC среды [95 мл DMEM/F12, 1 мл Penn / Strep (P / S), 1 мл N2, 2 мл B27, 100 мкл меркаптоэтанола (2ME, 50 мМ), шФРФ (20 нг / мл среды), IGF -1 (20 нг / мл среды) и ЭФР (20 нг / мл среды)] до фибронектина сухой плиты,

2. Извлечение клетки волосяного фолликула от головы человека

1. Перед началом процедуры выделения NCSCs, нужно подготовить соответствующие СМИ и реагентов (см. Таблицу 1).
2. Свежий взрослого человека кожа головы от подтяжку лица процедуры или FeТаль тканей волосистой части головы собирают, промывают PBS, содержащих пенициллин, стрептомицин.
3. Кожа затем переносят в 50 мл пробирок и инкубируют в DMEM с диспазы (10 мг / мл) в течение ночи при 4 ° C. Инкубация в течение 2-4 ч при 37 ° C является также эффективным. Кожа частей должна быть максимальной шириной 1 см, чтобы обеспечить фермента проникнуть.
4. Передача кожу в стерилизованные чашки Петри; снять каждый волос с поверхности кожи, держа волос у поверхности кожи и потянув твердо и гладко. Волосяные фолликулы показать морфологии либо анаген (рис. 1А) или телоген (рис. 1б).
5. Инкубируйте отдельные фрагменты фолликула в 0,05% трипсина-EDTA (Invitrogen) в течение 15-20 мин при комнатной температуре при встряхивании периодически добавляют 4 мл DMEM с 10% FBS, чтобы остановить реакцию. Фолликулярного эпителия трипсином и фильтруют через 40 мкм фильтр для получения одного-клеточной суспензии, содержащей клетки различного размера и формы.
6. Спинпри 200 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант осторожно, повторно приостанавливать в 1 мл PBS, содержащим 2% сыворотки (FBS).
7. Кроме того, сорвал волосяные фолликулы могут быть помещены в культуре без трипсина пищеварения расти волосы сферы на местах.

3. Выделение волосяной фолликул NCSCs помощью проточной цитометрии сортировки клеток

1. Волосяной фолликул одной клеточной суспензии были получены путем расщепления трипсином и меченные антитела к CD271 (APC-сопряженными) / HNK1 (FITC-конъюгированных), или CD271 / alpha4 интегрина (PE-сопряженных) в течение 40 минут на льду в темноте.
2. Центрифуга в течение 5 мин при 200 мкг при комнатной температуре и аспирации супернатант.
3. Ресуспендируют клеток в PBS, содержащем 2% сыворотки (FBS), и перед сортировкой, PI прибавляется к воротам из мертвых клеток.
4. Выполните сортировки клеток методом проточной цитометрии (FACS). Сбор CD271 +, HNK1 + двойной положительных клеток или CD271 +, alpha4 интегрина + двойной положительные клетки (рис. 2).
5. После сортировкиING, CD271 +, HNK1 + двойной положительных клеток или CD271 +, alpha4 интегрина + двойной позитивные клетки культивировали в ультра-низким пластин вложения в NCSC среде

4. Культура первичной NCSCs

1. Культура несогласие фолликулярных клеток или FACS отсортированных клеток в ультра-низких вложений пластин в NCSC среды, изменения средних каждый день.
2. Проверьте культуре клеток каждый день под микроскопом. NCSCs начнет формировать плавающие малых агрегатов через несколько дней и хорошо сформированной сферы в 2-5 недели в культуре в зависимости от возраста доноров (рис. 3А). Результат появится через несколько дней в регионе выпуклость и хорошо сформированной сферы на месте в течение нескольких недель (рис. 3б), когда целые волосяные фолликулы культивируют в NCSC среды.

5. Расширение NCSCs

1. Вымойте клетки с PBS раз.
2. Добавить подогретого (до 37 ° C, критическое) accutase и инкубировать при 37 ° С в течение 5-10мин при встряхивании периодически, чтобы убедиться, что нейронные стволовые клетки сферах распадается на одну клетку (для крепления культурного NCSC, инкубировать клетки с accutase при 37 ° C в течение 5 минут, чтобы убедиться, что клетки волосяных фолликулов стволовых отделена).
3. Вымойте и центрифуге клетках в два раза в течение 5 мин при 200 мкг при комнатной температуре в DMEM/F12 среде для удаления оставшихся решение accutase.
4. Повторное приостановить клеток с NCSC культуральной среде.
5. Для плавающего культуры, положить клеток в ультра-низким пластины крепления. Для крепления культуру, поставить в предварительно обработанные клетки пластины культуре ткани.

6. Представитель Результаты

NCSC культуральной среды является достаточным для поддержания hNCSCs в недифференцированное состояние без необходимости фидерных клеток. Кератиноциты не будет размножаться и постепенно умер в среду. Некоторые маленькие круглые клетки размножаются и образуют небольшие агрегатов в суспензии после 3 до 5 дней. Эти плавающие агрегаты медленно повышают яп размере, порожденный трехмерной сферы, как структуры, которую мы назвали волосы сферы (рис. 3А). Если культивировали в покрытых пластинами, NCSCs будет приложить к поверхности и не образуют сферы. Прилагаемый NCSCs расти быстрее, чем в суспензии. Сфере формирования и подключенными стволовых клеток выразить NCSCs маркеров. При всей фолликулы волос культуры, сферы формируются на области, соответствующей выпуклости области (рис. 3В).

Рисунок 1. Сорванные анаген (A) и телоген (B) волосяных фолликулов.

Рисунок 2. Представитель изображения FACS анализ NCSCs левой панели. Клетки закрытого использованием анти-CD271 и анти-Alphe 4 интегрина антителами. Справа: клетки закрытого использованием анти-CD271 и анти-антител HNK1.

Рисунок 3. Морфология волосы сферы (A) Морфология плавающей сферах волосы, левая панель. Низкой мощности, правая панель. Высокой мощности (B) Морфология волосы сферы на местах на Курской области, левой панели: волосы сфере на выпуклость телоген Правая панель: волосы сферы на Курской области волосяных фолликулов анагена.

Обсуждение

Изолятор и культуру методами, описанными являются воспроизводимыми и надежной. Мы создали NCSCs из десятков лиц в широком возрастном диапазоне. Хотя лучше всего для обработки ткани сразу после сбора урожая ткани, мы обнаружили, что кожа головы тканей можно безопасно хранить в средствах м...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Table 1.